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背景KZNF蛋白是哺乳动物体内最大的转录调控因子家族,它的蛋白结构中包括KRAB结构域和多个锌指结构。锌指结构近似一个手型，可以与目的基因特异结合，一个锌指结构可以与3~4核苷酸相互作用，不同锌指结构结合的DNA序列不同。KRAB结构域能够募集组蛋白甲基化转移酶、组蛋白去乙酰化酶、异染色质蛋白等抑制细胞转录。KZNF蛋白通过锌指结构与靶基因结合，再通过KRAB结构域抑制靶基因转录，参与细胞生命活动的调控。KZNF蛋白具有抑制RNA聚合酶I、II和III引物的转录，调控核仁功能，结合与剪接RNA的功能。Apak蛋白是本实验室发现与研究的一种KZNF蛋白，由ZNF420基因编码，是抑癌蛋白p53的负调控分子。在正常细胞中，Apak通过辅抑制蛋白KAP1聚集组蛋白去乙酰化酶HDAC1和ATM激酶与p53结合形成复合体，使p53的乙酰化水平下调，抑制p53相关的凋亡靶基因表达，抑制细胞凋亡，而对p53参与的其它生理功能没有明显的调控作用。在烷化剂MMS诱导的DNA损伤情况下，ATM被激活，Apak的Ser68位点发生磷酸化，磷酸化状态的Apak与p53解离，解除了对p53的抑制作用，p53激活，细胞凋亡。目的探讨作为KZNF家族的Apak蛋白是否有不依赖于p53的其它作用机制，Apak蛋白对细胞生长增殖有什么作用，Apak蛋白的表达与肿瘤有怎样的相关性，希望为肿瘤的早期诊断和防治提供新的预警分子。方法本实验采取病例对照研究设计，选取15例胃癌患者和20例结直肠癌患者肿瘤样本作为病例组，同一患者的肿瘤旁正常组织作为对照组，采用Westernblotting方法检测肿瘤组织中Apak蛋白的表达水平。培养H1299细胞，转染GFP-C3，GFP-Apak，shRNA-con，shRNA-Apak四种质粒，采用实时荧光定量PCR的方法检测rRNA的水平，采用流式细胞检测细胞周期，采用MTT方法检测细胞增殖，采用ChIP方法检测与Apak蛋白结合的DNA序列，并对结果进行分析。结果1、对本实验人群中的15例胃癌患者及20例结直肠癌患者的组织标本，采用Western blotting方法检测Apak蛋白表达水平，发现对于同一患者，与肿瘤旁正常组织相比，肿瘤组织中Apak蛋白水平下调，并且，p53突变的细胞中，Apak蛋白下调水平更显著，说明Apak蛋白在肿瘤组织中有不依赖于p53的其它作用机制。2、分四个培养瓶培养H1299细胞，分别转染GFP-C3，GFP-Apak，shRNA-con，shRNA-Apak四种质粒，转染48小时后，收细胞，提取细胞RNA，利用实时荧光定量PCR检测rRNA的表达水平，利用Western blotting方法检测Apak蛋白的表达水平，结果发现Apak蛋白能够抑制rRNA的合成。3、分两个培养瓶培养H1299细胞，分别转染GFP-C3，GFP-Apak两种质粒，48小时候后收细胞，使用流式细胞仪检测细胞周期，结果发现，Apak蛋白使大部分H1299细胞在G1期阻滞。4、在H1299细胞中，分别转染GFP-C3，GFP-Apak，shRNA-con，shRNA-Apak四种质粒，转染48h后，G418处理，2~3周后获得稳定表达Apak和稳定敲低Apak的细胞系，利用MTT方法检测细胞的增殖，结果发现Apak蛋白抑制细胞生长。5、利用染色质免疫沉淀方法（ChIP）发现Apak能够与45SpreRNA的调控区结合，其结合的DNA序列是TCTTN2-30TTGT。6、设置三个实验组，每组含有两瓶分别转染了shRNA-con和shRNA-Apak质粒的H1299细胞，第一组作为对照组，不加任何药剂；第二组加入TSA；第三组加入5’-Aza，一段时间后收细胞，提取细胞RNA，利用实时荧光定量PCR检测preRNA的水平。结果表明Apak能够使rRNA调控区发生甲基化，即Apak对rRNA调控区存在表观遗传学修饰。结论1、在肿瘤组织中Apak蛋白水平下调，并且，p53突变的细胞中，Apak蛋白下调水平更显著。2、Apak蛋白能够与45SpreRNA的调控区结合。3、Apak蛋白能够使rRNA调控区发生甲基化，即Apak对rRNA调控区存在表观遗传学修饰。4、Apak蛋白能够抑制rRNA的合成。5、Apak蛋白能够抑制细胞增长，使细胞在G1期阻滞。