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醛固酮在心血管疾病中的作用日益受到重视。临床研究显示醛固酮水平不适当升高可导致心脏受损。由于存在诸如样本量大小、人种差异、饮食、药物、伴发疾病以及伦理等因素的影响,在人体上研究过量醛固酮对心脏的影响比较困难,而动物实验可较好的控制这些因素。
既往动物实验显示过量醛固酮可通过氧化应激和炎症等途径导致心脏受损,然而这些研究绝大多数是在高醛固酮血症合并高钠盐饮食或低血钾的大鼠模型上进行的。在高钠盐饮食和低血钾的情况下,很难观察单纯过量醛固酮对心脏的确切作用。此外,临床上原发性醛固酮增多症以及其他如慢性心衰等存在高醛固酮血症的患者有相当一部分并不存在高钠盐饮食和低钾血症。因此有必要在正常钠盐饮食和正常血钾的情况下,进一步探讨过量醛固酮对心脏的影响及其作用机制。
再者,醛固酮和脂肪组织之间存在交互效应。醛固酮可促进脂肪细胞分化成熟,同时原醛症患者血浆脂联素水平较正常血压对照和原发性高血压患者低,但心脏损伤的风险却较高。脂联素是脂肪组织分泌的一种脂肪细胞因子,低脂联素水平预示着心血管疾病风险的增加。因此,脂联素可能与醛固酮介导的心脏损害有关。但原醛症患者血浆脂联素水平的下降是醛固酮直接作用于脂肪细胞引起还是由于高钠饮食、低钾血症或其他未知因素引起还不清楚。此外,已经明确脂肪细胞上存在盐皮质激素受体(MR),那么醛固酮有可能通过MR途径直接影响脂肪细胞脂联素的合成和分泌,这些均需进一步研究明确。
本研究主要目的:1.在无高钠盐饮食和低血钾的情况下,观察过量醛固酮作用4周对SD大鼠心肌结构以及炎症、氧化应激反应和血浆脂联素水平的影响。2.进行动物和细胞实验观察醛固酮可否直接作用于脂肪细胞引起脂联素表达变化?醛固酮的这种作用是否与MR有关?
第一部分醛固酮对SD大鼠心脏结构的影响
研究目的:
在正常钠盐饮食和正常血钾的情况下,探讨过量醛固酮作用4周对SD大鼠心肌结构以及炎症、氧化应激反应和血浆脂联素水平的影响。
研究方法:
1.实验分组
健康雄性SD大鼠随机分为三组(每组10只):①正常对照组(CON);②醛固酮组(ALD):醛固酮溶解在5%的乙醇中,装入微泵植入大鼠颈后皮下组织,以0.75μg/h的速度持续皮下输注4 w。③醛固酮+安体舒通组(SPI):皮下输注醛固酮,同时予以安体舒通100 mg.kg-1.day-1灌胃4 w。所有大鼠均自由摄食(含0.5%NaCl)。为防止醛固酮造成的低钾血症,自由饮用0.4%氯化钾水。
2.标本收集
实验结束前一日行代谢笼实验,留取24 h尿。实验结束当日,腹腔麻醉后,下腔静脉穿刺取血,迅速分离血浆,-80℃冻存备用。快速分离心脏,称重,留取左心室心肌标本行形态学和分子生物学检查。
3.观察指标
3.1基本参数的测定
记录24 h尿量和摄食量,测定24 h尿钠、钾排出量和同步血浆钠、钾浓度。RIA测定血浆醛固酮水平和血浆肾素活性。
3.2体重和血压监测
每周测量体重和血压。血压采用tail-cuff法测量大鼠清醒状态下收缩压(SBP)。
3.3心肌形态学检查
透射电镜和HE染色光镜下观察心肌形态学变化。
3.4免疫组化法检测心肌ED-1表达
阳性表达呈棕黄色,表示有单核/巨噬细胞浸润。
3.5比色法测定血浆和心肌氧化应激指标
丙二醛(MDA)水平和超氧化物歧化酶(SOD)活性反映氧化应激水平。
3.6实时PCR测定心肌NADPH氧化酶亚基p47phox和p22phox的基因表达
3.7 ELISA法测定血浆超敏C反应蛋白(hsCRP)和脂联素水平
4.统计学分析
数据均用均数±标准差表示,应用SPSS13.0进行统计学分析,组间比较采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。
小结:
1.在正常钠盐饮食和正常血钾的情况下,0.75μg/h醛固酮作用4周可引起SD大鼠电镜下心肌超微结构改变。
2.醛固酮作用4周导致SD大鼠心肌局部MDA水平、SOD活性和心肌p47phox基因表达增加,而此时心肌局部无明显炎症表现,提示醛固酮介导心肌局部氧化应激反应增强早于心肌炎症的出现。
3.醛固酮可导致SD大鼠血浆脂联素水平下降。
4.安体舒通可阻止过量醛固酮对心肌超微结构的损伤,这种作用不完全依赖于血压下降。
第二部分醛固酮对脂肪细胞脂联素表达的影响
研究目的:
在第一部分观察到醛固酮导致SD大鼠血浆脂联素水平降低的基础上,进行动物和细胞实验进一步观察醛固酮可否直接作用于脂肪细胞引起脂联素表达变化?醛固酮的这种作用是否与MR有关?
研究方法:
1.动物实验
实验动物分组、体重和血压监测、代谢指标观察以及血浆脂联素水平的测定同第一部分。实验结束时,下腔静脉穿刺取血,快速分离附睾脂肪垫脂肪组织,用于形态学和分子生物学分析。
2.细胞实验
3T3-L1前脂肪细胞诱导分化为成熟脂肪细胞,油红O染色鉴定。实验分为5组,分别是对照组(CON):含25 mmol/L葡萄糖DMEM高糖培养;低醛固酮组(LA)和高醛固酮组(HA):分别含10-8和10-6 mol/L醛固酮;低醛固酮+安体舒通组(LA+SP)和高醛固酮+安体舒通组(HA+SP):分别含10-8和10-6 mol/L醛固酮加10-6mol/L安体舒通。每组分别处理24 h和48 h。重复3次。
3.免疫组化染色分析脂肪组织MR表达
4.ELISA法检测大鼠血浆和细胞培养液中脂联素水平
5.实时定量PCR检测大鼠脂肪组织及3T3-L1脂肪细胞脂联素和MR mRNA表达
6.免疫印迹法检测大鼠脂肪组织及3T3-L1脂肪细胞胞浆和胞核中MR总蛋白表达
7.统计学分析
同第一部分
小结:
1.醛固酮可通过MR途径抑制3T3-L1脂肪细胞脂联素的基因表达和蛋白分泌。
2.安体舒通可逆转醛固酮对3T3-L1脂肪细胞脂联素表达的影响。
3.醛固酮可促进3T3-L1脂肪细胞MR基因表达,但对MR总蛋白表达量的影响尚不明确。