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1.研究背景及目的
慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B)简称乙肝，是一种由乙肝病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染引起的以肝损伤为主的感染性疾病，具有很强的传染性。据统计全球约有HBV感染者二十亿人，而我国是乙肝的高发病区。随着乙肝病情的发展，会出现不同程度肝损伤，有的甚至转化成肝癌。目前，治疗乙肝的药物均存在不同程度的副作用和耐药性问题。因此，研究和开发新型高效低毒的抗HBV药物一直是国内外研究的热点。特别是继青蒿素的高效抗疟疾作用被世界认可以来，从中药和天然药物中寻找抗HBV的潜在药物备受世界瞩目。
椿皮始载于《新修本草》，具有清热燥湿、收敛止带、止泻、止血之功效，常用于赤白带下、湿热泻痢；煎汤外洗，可用治皮肤疮癣。其主要化学成分有生物碱类、苦木素类、萜类、甾醇类、糖苷类、黄酮类、蒽醌类、香豆素类等，其中臭椿苦酮(Ailanthone，C20H24O7)是椿皮中的一种五环二萜类化合物成分。椿皮在乙肝的临床治疗中表现出良好的效果，但其功效成分和作用机制尚未见报道。本课题拟建立椿皮药材的指纹图谱和分析椿皮水提物中臭椿苦酮化学成分，建立从椿皮药材中提取分离臭椿苦酮的制备工艺，探讨椿皮水提物、臭椿苦酮抗HBV作用及其初步机制和肝保护作用。
2.实验方法
2.1分析椿皮水提物中主要化学成分并建立其指纹图谱：建立椿皮水提物HPLC指纹图谱检测方法，检测10个不同产地的椿皮水提物中臭椿苦酮的含量。通过分析比对10个不同产地椿皮药材的HPLC指纹，建立椿皮水提物指纹图谱。
2.2制定臭椿苦酮的提取-分离-纯化工艺及其质量标准：采用正交实验设计，优化椿皮中提取、分离和纯化臭椿苦酮的各参数；结晶和硅胶柱色谱法优化臭椿苦酮的精制方法；以臭椿苦酮标准品为对照，TLC跟踪监测，分别检测各留份(洗脱液，浓缩、精制、纯化)富集臭椿苦酮的含量(纯度＞95%)；理化常数分析和波谱检测，数据分析确定臭椿苦酮结构；建立从椿皮中提取、分离和纯化臭椿苦酮的制备工艺、HPLC法检测椿皮浸膏和臭椿苦酮的含量方法并建立臭椿苦酮质量标准。
2.3明确椿皮水提物和臭椿苦酮的抗HBV作用和机制：MTT法检测椿皮水提物、臭椿苦酮和阳性对照药即拉米夫定、恩替卡韦对HepG2.2.15的最大无毒剂量，并以此剂量逐倍稀释，分别用ELISA和PCR法检测四种受试药物对HBsAg、HBeAg的分泌和HBV-DNA复制的抑制率，评价各受试药对HBV的抑制效应。分别用反转录PCR和Westernblot法检测各受试药对HBV复制的关键作用环节3.5kbmRNA、肝细胞核因子(HNF1α、HNF4α)的基因和蛋白表达的影响；探讨椿皮水提物和臭椿苦酮抗HBV的作用及其机制。
2.4探讨椿皮水提物和臭椿苦酮对三种肝损伤的作用：C57BL/J小鼠腹部皮下注射10mL/kg20%CC14橄榄油溶液，一周2次，连续6周，复制CC14诱导的慢性化学性肝损伤模型；C57BL/J小鼠腹腔注射10mL/kgD-氨基半乳糖和脂多糖(LPS)的混合液，每二天1次，造模6周，复制D-氨基半乳糖联合脂多糖诱导的慢性化学性肝损伤模型；C57BL/J小鼠尾静脉注射卡介苗(BCG)2.5mg/0.2mL/只，每天1次，连续12天，末次给药3h后按10μg/0.2mL/只剂量尾静脉注射LPS，复制BCG+LPS诱导的急性免疫性肝损伤模型。在造模的同时，给予椿皮水提物、臭椿苦酮和联苯双脂(阳性对照)；给药结束后，取肝脏和脾脏称重，计算脏器指数；收集血清检测转氨酶指标(ALT、AST)；肝组织匀浆检测氧化、抗氧化指标(MDA、SOD)；取肝脏组织进行HE染色，综合评价受试药物对三种肝损伤模型小鼠的肝保护作用，为其深入研究提供实验依据。
3.结果
3.1证实椿皮水提物中臭椿苦酮含量高并建立其指纹图谱：制定了HPLC法检测椿皮水提物中臭椿苦酮含量的方法，该方法操作简便，灵敏度、重复性和稳定性均好；首次建立了10个不同产地的椿皮水提物HPLC指纹图谱，RSD值小于2%，表明检测方法稳定，重复性好。分析结果发现，不同产地椿皮药材中臭椿苦酮的含量差异较大，以河南产椿皮中臭椿苦酮含量最高(0.1788%)，其次为安徽(0.0755%)、江苏(0.0722%)、陕西(0.064%)等地。
3.2首次制定了椿皮中臭椿苦酮的制备工艺及其质量标准：以臭椿苦酮提取率为指标，比较了椿皮的水提和醇提工艺，发现以醇提法更好，最佳工艺为椿皮药材加6倍量80%乙醇，提取2次，每次1h。小试、适应性中试试验，其工艺重复性与稳定性良好；对比结晶法和硅胶柱层析法两种纯化、精制方法，结果表明结晶法工艺流程简单，收率高，重复性与稳定性良好，为其中试放大生产提供了重要条件。将纯化得到的样品经HPLC、UV全波长扫描、13C-NMR谱和1H-NMR谱结构鉴定，结果与标准品和文献报道一致，证明其为臭椿苦酮；依据2015年版《中国药典》四部(附录)水分、灰分和HPLC检测等方法，对椿皮中提取的臭椿苦酮进行了定性、定量及相关检查，制定了臭椿苦酮质量标准，并规定臭椿苦酮原料药采用HPLC法测定，以C20H24O7计其含量不得低于95%。
3.3椿皮水提物和臭椿苦酮显著抑制HBsAg、HBeAg分泌和HBV-DNA复制：首次证实椿皮水提物和臭椿苦酮对HepG2.2.15细胞的最大无毒剂量分别为1.4mg/mL(相当于椿皮原药材0.06g/mL)和0.039mg/mL，并在该剂量下对HBsAg的抑制率分别为98.10%和99.64%，对HBeAg的抑制率分别为94.47%和91.44%，抑制活性均显著优于恩替卡韦(P＜0.001)；对HBV-DNA的抑制率分别为91.52%和88.29%，与恩替卡韦的活性相当(P＞0.05)。实验结果证实，1.4mg/mL椿皮水提物(折算含臭椿苦酮为0.036mg/mL)与0.039mg/mL臭椿苦酮的活性基本相当；由此说明，臭椿苦酮很可能是椿皮水提物中抗HBV的主要功效成分。
3.4初步揭示椿皮水提物和臭椿苦酮抗HBV活性机制与其抑制HBV-RNA合成有关：反转录PCR和WesternBlot检测结果表明，椿皮水提物和臭椿苦酮显著抑制3.5kbmRNA、HNF1α和HNF4α的基因表达(P＜0.05)，而拉米夫定和恩替卡韦则对以上肝细胞核因子的表达无显著影响(P＞0.05)。由此推测，椿皮水提物和臭椿苦酮抗HBV的活性机制与拉米夫定和恩替卡韦不同，可能与其抑制宿主肝细胞核因子HNF1α和HNF4α的表达，抑制HBV-RNA合成，终止HBV复制密切相关。
3.5证实椿皮水提物和臭椿苦酮对小鼠三种实验性肝损伤具有显著的肝保护作用：在三种实验性肝损伤模型中，椿皮水提物和臭椿苦酮各剂量给药组均显著降低小鼠血清AST、ALT和肝组织中MDA水平(P＜0.05)；升高肝组织中SOD含量(P＜0.05)；显著改善小鼠的肝脏和脾脏指数(P＜0.05)；对小鼠三种实验性肝损伤的病变具有明显的改善作用。
4.结论
建立了灵敏、快速、高效HPLC法检测椿皮水提物中臭椿苦酮含量和椿皮水提物的指纹图谱，对椿皮中获得的臭椿苦酮进行了结构表征并证实其与标准品和文献报道一致；制定了陕产椿皮药材中提取、分离和纯化臭椿苦酮适应性中试生产工艺和臭椿苦酮的质量标准；首次证实椿皮水提物和臭椿苦酮具有显著抑制HBsAg、HBeAg分泌和HBV-DNA复制、显著抑制3.5kbmRNA、HNF1α和HNF4α的表达(P＜0.05)的活性。提示椿皮水提物和臭椿苦酮抗HBV的活性机制可能与其抑制宿主肝细胞核因子(HNF1α和HNF4α)的表达，影响HBV-RNA合成，进而抑制HBV-DNA的复制密切相关；椿皮水提物和臭椿苦酮对实验性肝损伤亦具有显著保护作用。
综上所述，本研究首次证实椿皮水提物和臭椿苦酮具有显著抗HBV活性，而臭椿苦酮可能是椿皮抗HBV的有效成分，其活性机制可能与其抑制HBV-DNA复制相关。该发现为后期椿皮和臭椿苦酮治疗慢性乙型肝炎和肝损伤的药物研发提供了实验依据和数据支持。
慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B)简称乙肝，是一种由乙肝病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染引起的以肝损伤为主的感染性疾病，具有很强的传染性。据统计全球约有HBV感染者二十亿人，而我国是乙肝的高发病区。随着乙肝病情的发展，会出现不同程度肝损伤，有的甚至转化成肝癌。目前，治疗乙肝的药物均存在不同程度的副作用和耐药性问题。因此，研究和开发新型高效低毒的抗HBV药物一直是国内外研究的热点。特别是继青蒿素的高效抗疟疾作用被世界认可以来，从中药和天然药物中寻找抗HBV的潜在药物备受世界瞩目。
椿皮始载于《新修本草》，具有清热燥湿、收敛止带、止泻、止血之功效，常用于赤白带下、湿热泻痢；煎汤外洗，可用治皮肤疮癣。其主要化学成分有生物碱类、苦木素类、萜类、甾醇类、糖苷类、黄酮类、蒽醌类、香豆素类等，其中臭椿苦酮(Ailanthone，C20H24O7)是椿皮中的一种五环二萜类化合物成分。椿皮在乙肝的临床治疗中表现出良好的效果，但其功效成分和作用机制尚未见报道。本课题拟建立椿皮药材的指纹图谱和分析椿皮水提物中臭椿苦酮化学成分，建立从椿皮药材中提取分离臭椿苦酮的制备工艺，探讨椿皮水提物、臭椿苦酮抗HBV作用及其初步机制和肝保护作用。
2.实验方法
2.1分析椿皮水提物中主要化学成分并建立其指纹图谱：建立椿皮水提物HPLC指纹图谱检测方法，检测10个不同产地的椿皮水提物中臭椿苦酮的含量。通过分析比对10个不同产地椿皮药材的HPLC指纹，建立椿皮水提物指纹图谱。
2.2制定臭椿苦酮的提取-分离-纯化工艺及其质量标准：采用正交实验设计，优化椿皮中提取、分离和纯化臭椿苦酮的各参数；结晶和硅胶柱色谱法优化臭椿苦酮的精制方法；以臭椿苦酮标准品为对照，TLC跟踪监测，分别检测各留份(洗脱液，浓缩、精制、纯化)富集臭椿苦酮的含量(纯度＞95%)；理化常数分析和波谱检测，数据分析确定臭椿苦酮结构；建立从椿皮中提取、分离和纯化臭椿苦酮的制备工艺、HPLC法检测椿皮浸膏和臭椿苦酮的含量方法并建立臭椿苦酮质量标准。
2.3明确椿皮水提物和臭椿苦酮的抗HBV作用和机制：MTT法检测椿皮水提物、臭椿苦酮和阳性对照药即拉米夫定、恩替卡韦对HepG2.2.15的最大无毒剂量，并以此剂量逐倍稀释，分别用ELISA和PCR法检测四种受试药物对HBsAg、HBeAg的分泌和HBV-DNA复制的抑制率，评价各受试药对HBV的抑制效应。分别用反转录PCR和Westernblot法检测各受试药对HBV复制的关键作用环节3.5kbmRNA、肝细胞核因子(HNF1α、HNF4α)的基因和蛋白表达的影响；探讨椿皮水提物和臭椿苦酮抗HBV的作用及其机制。
2.4探讨椿皮水提物和臭椿苦酮对三种肝损伤的作用：C57BL/J小鼠腹部皮下注射10mL/kg20%CC14橄榄油溶液，一周2次，连续6周，复制CC14诱导的慢性化学性肝损伤模型；C57BL/J小鼠腹腔注射10mL/kgD-氨基半乳糖和脂多糖(LPS)的混合液，每二天1次，造模6周，复制D-氨基半乳糖联合脂多糖诱导的慢性化学性肝损伤模型；C57BL/J小鼠尾静脉注射卡介苗(BCG)2.5mg/0.2mL/只，每天1次，连续12天，末次给药3h后按10μg/0.2mL/只剂量尾静脉注射LPS，复制BCG+LPS诱导的急性免疫性肝损伤模型。在造模的同时，给予椿皮水提物、臭椿苦酮和联苯双脂(阳性对照)；给药结束后，取肝脏和脾脏称重，计算脏器指数；收集血清检测转氨酶指标(ALT、AST)；肝组织匀浆检测氧化、抗氧化指标(MDA、SOD)；取肝脏组织进行HE染色，综合评价受试药物对三种肝损伤模型小鼠的肝保护作用，为其深入研究提供实验依据。
3.结果
3.1证实椿皮水提物中臭椿苦酮含量高并建立其指纹图谱：制定了HPLC法检测椿皮水提物中臭椿苦酮含量的方法，该方法操作简便，灵敏度、重复性和稳定性均好；首次建立了10个不同产地的椿皮水提物HPLC指纹图谱，RSD值小于2%，表明检测方法稳定，重复性好。分析结果发现，不同产地椿皮药材中臭椿苦酮的含量差异较大，以河南产椿皮中臭椿苦酮含量最高(0.1788%)，其次为安徽(0.0755%)、江苏(0.0722%)、陕西(0.064%)等地。
3.2首次制定了椿皮中臭椿苦酮的制备工艺及其质量标准：以臭椿苦酮提取率为指标，比较了椿皮的水提和醇提工艺，发现以醇提法更好，最佳工艺为椿皮药材加6倍量80%乙醇，提取2次，每次1h。小试、适应性中试试验，其工艺重复性与稳定性良好；对比结晶法和硅胶柱层析法两种纯化、精制方法，结果表明结晶法工艺流程简单，收率高，重复性与稳定性良好，为其中试放大生产提供了重要条件。将纯化得到的样品经HPLC、UV全波长扫描、13C-NMR谱和1H-NMR谱结构鉴定，结果与标准品和文献报道一致，证明其为臭椿苦酮；依据2015年版《中国药典》四部(附录)水分、灰分和HPLC检测等方法，对椿皮中提取的臭椿苦酮进行了定性、定量及相关检查，制定了臭椿苦酮质量标准，并规定臭椿苦酮原料药采用HPLC法测定，以C20H24O7计其含量不得低于95%。
3.3椿皮水提物和臭椿苦酮显著抑制HBsAg、HBeAg分泌和HBV-DNA复制：首次证实椿皮水提物和臭椿苦酮对HepG2.2.15细胞的最大无毒剂量分别为1.4mg/mL(相当于椿皮原药材0.06g/mL)和0.039mg/mL，并在该剂量下对HBsAg的抑制率分别为98.10%和99.64%，对HBeAg的抑制率分别为94.47%和91.44%，抑制活性均显著优于恩替卡韦(P＜0.001)；对HBV-DNA的抑制率分别为91.52%和88.29%，与恩替卡韦的活性相当(P＞0.05)。实验结果证实，1.4mg/mL椿皮水提物(折算含臭椿苦酮为0.036mg/mL)与0.039mg/mL臭椿苦酮的活性基本相当；由此说明，臭椿苦酮很可能是椿皮水提物中抗HBV的主要功效成分。
3.4初步揭示椿皮水提物和臭椿苦酮抗HBV活性机制与其抑制HBV-RNA合成有关：反转录PCR和WesternBlot检测结果表明，椿皮水提物和臭椿苦酮显著抑制3.5kbmRNA、HNF1α和HNF4α的基因表达(P＜0.05)，而拉米夫定和恩替卡韦则对以上肝细胞核因子的表达无显著影响(P＞0.05)。由此推测，椿皮水提物和臭椿苦酮抗HBV的活性机制与拉米夫定和恩替卡韦不同，可能与其抑制宿主肝细胞核因子HNF1α和HNF4α的表达，抑制HBV-RNA合成，终止HBV复制密切相关。
3.5证实椿皮水提物和臭椿苦酮对小鼠三种实验性肝损伤具有显著的肝保护作用：在三种实验性肝损伤模型中，椿皮水提物和臭椿苦酮各剂量给药组均显著降低小鼠血清AST、ALT和肝组织中MDA水平(P＜0.05)；升高肝组织中SOD含量(P＜0.05)；显著改善小鼠的肝脏和脾脏指数(P＜0.05)；对小鼠三种实验性肝损伤的病变具有明显的改善作用。
4.结论
建立了灵敏、快速、高效HPLC法检测椿皮水提物中臭椿苦酮含量和椿皮水提物的指纹图谱，对椿皮中获得的臭椿苦酮进行了结构表征并证实其与标准品和文献报道一致；制定了陕产椿皮药材中提取、分离和纯化臭椿苦酮适应性中试生产工艺和臭椿苦酮的质量标准；首次证实椿皮水提物和臭椿苦酮具有显著抑制HBsAg、HBeAg分泌和HBV-DNA复制、显著抑制3.5kbmRNA、HNF1α和HNF4α的表达(P＜0.05)的活性。提示椿皮水提物和臭椿苦酮抗HBV的活性机制可能与其抑制宿主肝细胞核因子(HNF1α和HNF4α)的表达，影响HBV-RNA合成，进而抑制HBV-DNA的复制密切相关；椿皮水提物和臭椿苦酮对实验性肝损伤亦具有显著保护作用。
综上所述，本研究首次证实椿皮水提物和臭椿苦酮具有显著抗HBV活性，而臭椿苦酮可能是椿皮抗HBV的有效成分，其活性机制可能与其抑制HBV-DNA复制相关。该发现为后期椿皮和臭椿苦酮治疗慢性乙型肝炎和肝损伤的药物研发提供了实验依据和数据支持。