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目的观察三个针对人转化生长因子β1(TGF-β1)的小发夹RNA(shRNA)真核表达质粒(shRNA1、shRNA2、shRNA3)对人肺成纤维细胞TGF-β1基因表达的抑制作用,并筛选出其中抑制效应最佳的质粒。观察抑制TGF-β1基因表达对人肺成纤维细胞生长的影响,并初步评价其应用的安全性,为进一步研究RNAi在肺纤维化基因治疗中的应用提供实验依据。方法将构建完成的三个针对人转化生长因子β1(TGF-β1)的小发夹RNA(shRNA)真核表达质粒(shRNA1、shRNA2、shRNA3)和对应的阴性对照质粒(Control组、Control2组、Control3)进行酶切鉴定和DNA测序分析。在Lipofectamine2000介导下分别将上述质粒转染人肺成纤维细胞,分组命名为shRNA1组、shRNA2组、shRNA3组、Control组、Control2组、Control3组并设立未转染空白对照组。转染48h后应用实时荧光定量PCR检测人肺成纤维细胞TGF-β1mRNA的表达水平和ELISA检测细胞上清液中TGF-β1蛋白质含量。转染48h后在光镜下观察各组细胞的形态学变化并经台盼篮染色计算各组人肺成纤维细胞死亡率。结果转染48h后,与未转染对照组相比,各组shRNA mRNA水平均有所下调,shRNA1组、shRNA2组、shRNA3组mRNA相对表达量分别为0.088±0.008、0.022±0.004、0.197±0.030(P＜0.05)。各Control组与未转染对照组相比,差异无显著性(P＞0.05),Control组间比较差异无显著性(P＞0.05)。各shRNA1、shRNA2、shRNA3组细胞上清液中TGF-β1蛋白水平均下降,各组蛋白抑制率为分别为47.7±2.4%、77.4±2.2%、27.3±2.5%(P＜0.001)。各Control组与未转染对照组相比,差异无显著性(P＞0.05),Control组间比较差异无显著性(P＞0.05)。光镜下观察各组细胞形态学变化,各处理组细胞与未转染组相比,差异无显著性(P＞0.05)。通过台盼蓝染色计数,各shRNA组的细胞死亡率在9%～16%,与未转染对照组相比,差异无显著性(P＞0.05),shRNA2组与其他shRNA组比较差异无显著性(P＞0.05)。各Control组与未转染对照组相比,差异无显著性(P＞0.05),Control组间比较差异无显著性(P＞0.05)。结论三个特异性TGF-β1真核小发夹RNA表达质粒(shRNA1、shRNA2、shRNA3)均能抑制人肺成纤维细胞中TGF-β1的mRNA表达及蛋白合成,其中以shRNA2的干扰效应最佳。与未转染对照组相比,各个shRNA组在细胞形态学和细胞死亡率上没有显著差别。shRNA2能高效、安全地抑制TGF-β1基因在人肺成纤维细胞中的表达。