论文部分内容阅读
全身麻醉药物自1846年首次公开应用于临床,从而揭开了现代手术外科学发展的序幕。2015年临床权威杂志Lancet报道数据显示,全球每年约完成3.18亿例手术,其中大部分接受全身麻醉。然而全麻药物是如何发挥作用、实现可逆性的意识消失?至今仍不是很清楚。阐明全麻药物的作用机制不仅有利其临床更加安全有效地应用和新型麻醉药物的研发,更会对神经科学领域其他方面研究,如“意识是如何形成的”起到深远影响。正如Nat Rev Neurosci中提到:认识全麻药物作用的分子机制是神经科学领域内亟待解决的重要科学问题。自从麻醉药物问世至今,人们往往把麻醉状态比作为睡眠,两者都表现为对外部环境刺激反应的抑制和觉醒水平的降低,并且越来越多的研究发现全麻药物可以部分通过脑内睡眠觉醒相关系统而发挥作用。基底前脑区位于下丘脑前部,包含有GABA能、谷氨酸能、胆碱能神经元,是网状上行激活系统在腹内侧的最后一站,参与调节多种生理功能,在睡眠觉醒周期转换、觉醒状态维持等生理活动中发挥重要作用,但其在麻醉中的作用还不很了解。七氟烷是临床上常用的吸入全麻药物,以往研究发现吸入麻醉药氟烷、安氟烷和异氟烷均可以提高GABA能神经元神经末梢递质的释放,表明GABA能神经元可能是吸入麻醉剂的作用靶点之一,但全麻药物对抑制性中间神经元的影响还鲜有研究。本研究采用膜片钳技术观察离体条件下吸入性麻醉药七氟烷对基底前脑区GABA能中间神经元及突触后锥体神经元电活动的影响,并结合麻醉行为学观察,揭示不同类型神经元在麻醉效应中的作用,为基底前脑区参与并调节麻醉-觉醒的机制提供新证据。实验一七氟烷对基底前脑区GABA能中间神经元及突触后锥体神经元电活动的影响目的:观察七氟烷对基底前脑区中间神经元膜电位,放电频率及锥体神经元抑制性突触后电流的影响。方法:4-6周龄,雄性C57BL/6小鼠,切取带有基底前脑区的脑片,在室温(21-24℃)孵育。然后记录并比较基底前脑区中间神经元灌流饱和七氟烷的人工脑脊液前、后的动作电位、膜电位、刺激电流下神经元放电规律变化;锥体神经元灌流饱和七氟烷的人工脑脊液前、后的s IPSC/m IPSC频率、幅值的变化情况。结果:电流钳模式下,采用K+电极内液,记录神经元动作电位频率,给药前动作电位频率为(0.2±0.04)Hz,饱和七氟烷的人工脑脊液灌流后动作频率明显增加为(0.45±0.06 Hz,P<0.001);灌流前膜电位为(-71.2±2.1 m V),七氟烷灌流后膜电位为(-68.1±2.3 m V),呈现去极化;给予中间神经元80 p A恒定电流,给药前动作电位的数量为(27.1±2.8),七氟烷处理后动作电位的数量为(38.2±0.9),前后对照表明:七氟烷可以增加中间神经元去极化电流引起的动作电位频率(P<0.05)。电压钳模式下,膜电位钳制在+30 m V,采用Cs+电极内液,记录神经元s IPSC,给药前s IPSC频率为(2.0±0.2)Hz,幅值(28.1±2.7)p A,饱和七氟烷人工脑脊液灌流后s IPSC频率为(2.8±0.4)Hz,幅值(47.6±4.1)p A,前后对照表明:七氟烷可以增加锥体神经元抑制性突触后电流频率和幅值(P<0.05);给药前m IPSC频率为(0.8±0.5)Hz,幅值为(20.3±2.5)p A,七氟烷处理后m IPSC频率为(1.1±0.4)Hz,幅值为(22.4±1.2)p A,前后对照表明:七氟烷对锥体神经元微小抑制性突触后电流频率无明显影响。实验二调控基底前脑区GABA能/谷氨酸能神经元对七氟烷麻醉觉醒的影响目的:观察通过核团微注射的方法调控基底前脑区GABA能及谷氨酸能系统之后七氟烷麻醉觉醒时间的变化。方法:8-12周龄,雄性C57BL/6小鼠,按随机分组法将120只小鼠分成24组,每组5只。在10%水合氯醛麻醉腹腔麻醉下,将套管针定位于基底前脑区,并固定在颅骨表面。模型制作完成后休息5天再进行七氟烷麻醉行为学实验。实验中将小鼠放入麻醉翻转箱并持续给与1 MAC(2.4%)七氟烷,翻正反射消失后的第15 min,同一组小鼠分别给予0.3μl溶剂、两种剂量GABA/谷氨酸受体激动剂/拮抗剂。翻正反射消失后第30 min停止通入七氟烷,记录麻醉停止至小鼠翻正反射恢复时间为麻醉觉醒时间。结果:基底前脑区微注射GABA受体激动剂muscimol后,50 pmol组和100 pmol组均可以延长七氟烷麻醉觉醒时间(P<0.05);而给予GABA受体拮抗剂bicuculline后,50 pmol组平均觉醒时间有延长趋势,但没有统计学差异,100 pmol组则可以显著延长麻醉后觉醒时间(P<0.05)。基底前脑区微注射谷氨酸NMDA受体激动剂Glu/NMDA后,与对照组相比,1nmol和2 nmol Glu组七氟烷麻醉后觉醒时间都明显缩短(P<0.05);1 nmol NMDA组觉醒时间延长(P<0.05),2 nmol NMDA组则可以显著缩短觉醒时间(P<0.01)。给予谷氨酸NMDA受体拮抗剂DL-AP5后,与对照组相比,1 nmol和2 nmol DL-AP5都显著延长觉醒时间(P<0.01),0.5 nmol MK-801平均觉醒时间轻微延长,无统计学差异,1 nmol MK-801可以明显延长觉醒时间(P<0.01)。BF区微注射谷氨酸AMPA受体激动剂AMPA后,与对照组相比,100 pmol AMPA组平均觉醒时间轻微减少,无统计学差异,1 nmol AMPA组可以显著缩短觉醒时间(P<0.01);而给予谷氨酸AMPA受体拮抗剂CNQX后,1 nmol CNQX组觉醒时间延长,但并无统计学差异,2 nmol CNQX组麻醉后觉醒时间显著延长(P<0.05)。结论本研究中我们证明:七氟烷可以直接兴奋基底前脑区突触前GABA能中间神经元,从而增强突触后锥体神经元抑制性突触后电流。激活或抑制基底前脑区GABA能系统均可以延长七氟烷的麻醉效应;增强基底前脑区谷氨酸能神经系统可以缩短麻醉觉醒时间,抑制谷氨酸能系统延长觉醒时间。综上所述,调控基底前脑区兴奋性和抑制性递质可对麻醉后的觉醒产生明显影响,七氟烷对该区抑制性中间神经元的直接激活作用在此过程中扮演了重要角色。