目的:以NLRP3炎症小体通路为靶标,探讨丹参靶向NLRP3炎症小体的活性成分,并揭示其作用机制和靶点,阐明丹参抗炎物质基础和具体作用机制,并进一步体内评价丹参活性成分对NLRP3炎症小体介导的炎性疾病,脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）诱导的小鼠脓毒血症和蛋氨酸胆碱缺乏（Methionine and choline deficient,MCD）饮食诱导的小鼠非酒精性脂肪肝炎（Nonalcoholic steatohepatitis,NASH）的治疗作用,探讨丹参作为NLRP3炎症小体相关疾病治疗药物的可能性和安全性,为抗炎药物的开发提供科学依据。方法:本课题首先构建NLRP3炎症小体活化的细胞模型,筛选出丹参中抑制NLRP3炎症小体的活性成分隐丹参酮和丹参酮Ⅰ。采用细胞水平和动物整体水平实验相结合的方法,揭示隐丹参酮和丹参酮Ⅰ靶向NLRP3炎症小体抗炎效应的分子机制。在细胞水平上以小鼠骨髓来源巨噬细胞BMDMs和人源巨噬细胞THP-1为载体,构建经典和非经典NLRP3炎症小体、NLRC4炎症小体以及AIM2炎症小体活化模型。拟从NLRP3炎症小体激活的多个节点分析隐丹参酮和丹参酮Ⅰ对其激活的影响,逐步锁定隐丹参酮和丹参酮Ⅰ影响NLRP3炎症小体激活的作用方式,观察隐丹参酮和丹参酮Ⅰ对不同炎症小体信号通路的影响。丹参有效成分分别处理BMDMs细胞,CCK8法测定细胞活性,明确丹参各有效成分的安全范围;免疫印迹法检测细胞上清中caspase-1 p20、IL-1βp17和裂解液中pro-caspase-1和pro-IL-1β、NLRP3、ASC蛋白表达;生物发光法检测caspase-1的活性;ELISA法测定细胞上清中IL-1β、TNF-a的含量;利用试剂盒检测细胞上清乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase,LDH）的释放,评价隐丹参酮对NLRP3炎症小体活化后细胞焦亡的影响;通过蛋白寡聚化偶联剂DSS（Disuccinimidyl suberate,双琥珀酰亚胺辛二酸酯）交联分析,免疫印迹检测寡聚化的ASC多聚体;利用电感耦合等离子体质谱法测量细胞内K+。FLIPRT Tetra高通量实时荧光检测分析系统（Molecular Devices,美国）测量细胞内Ca2+。流式细胞术检测细胞内线粒体活性氧（mitochondrial reactive oxygen species,mtROS）的产生。在动物整体水平上验证隐丹参酮和丹参酮Ⅰ对NLRP3炎症小体的抑制作用。构建基于NLRP3炎症小体的LPS诱导的脓毒血症C57BL/6J小鼠模型:首先观察隐丹参酮和丹参酮Ⅰ对小鼠生存率的影响,然后观察丹参主要成分隐丹参酮和丹参酮Ⅰ干预后小鼠的一般状态,用ELISA测定了血清和腹腔灌洗液中IL-1β、TNF-α的含量,流式细胞仪测定腹腔液中中性粒细胞、单核巨噬细胞比例。构建MCD饮食诱导NASH小鼠模型:观察隐丹参酮和丹参酮Ⅰ对小鼠生存状态和体重的影响,流式细胞仪检测全血免疫细胞Th17/Treg细胞比例,ELISA法测定血清中炎症因子IL-17A水平;采用HE、天狼星红、马松染色观察肝组织的病理改变,试剂盒测定血清中ALT、AST水平,qRT-PCR法测定肝组织α-SMA、Col1a1、IL-1β、NLRP3mRNA的表达。Western blot法测定肝组织中pro-caspase-1,caspase-1 p20蛋白表达。结果:本课题组通过前期筛选发现丹参中多种成分能显著抑制NLRP3炎症小体激活,综合考虑选取隐丹参酮和丹参酮Ⅰ进行下一步研究。以nigericin和ATP为NLRP3炎症小体诱导剂时,隐丹参酮和丹参酮Ⅰ在无细胞毒性情况下能下调BMDMs细胞上清caspase-1 p20和IL-1β的表达（P<0.05）,但对细胞裂解液中pro-IL-1β和NLRP3、ASC、pro-caspase-1蛋白表达几乎无影响。进一步的探究发现隐丹参酮和丹参酮Ⅰ都能够抑制nigericin、ATP、SiO2、poly（I:C）诱导的经典NLRP3炎症小体活化,以及抑制胞内转染LPS诱导的非经典NLRP3炎症小体的活化引起的细胞上清中caspase-1 p20、IL-1βp17蛋白的表达（P<0.05）,而对poly（dA:dT）活化的AIM2炎症小体,沙门氏菌活化的NLRC4炎症小体的激活引起的caspase-1 p20、IL-1βp17蛋白的表达无影响（P>0.05）。NLRP3炎症小体的激活需要两个信号,预处理（priming）信号和活化信号。在LPS之前或之后加入隐丹参酮,对LPS预处理信号导致的TNF-α产生以及pro-IL-1β,NLRP3的表达没有影响,提示在本研究确定的剂量范围内隐丹参酮特异性的影响NLRP3炎症小体活化,而不影响NF-κB信号通路。而与之不同的是,LPS之前加入丹参酮Ⅰ,对LPS预处理信号导致的pro-IL-1β、TNF-α表达有下调作用,提示丹参酮Ⅰ对NF-κB信号通路有抑制作用。隐丹参酮和丹参酮Ⅰ均能抑制经典和非经典NLRP3炎症小体ASC寡聚化,但对NLRC4,AIM2炎症小体ASC寡聚化作用无影响,说明隐丹参酮和丹参酮Ⅰ均对NLRP3炎症小体组装有抑制作用。结果表明隐丹参酮和丹参酮Ⅰ均对NLRP3炎症小体激活过程中K+外流无影响。而隐丹参酮可以降低NLRP3炎症小体激活过程中细胞内钙离子的浓度,且呈剂量依赖性。隐丹参酮还可以降低炎症小体激活过程中细胞内mtROS的产生。在动物整体水平上,隐丹参酮和丹参酮Ⅰ对NLRP3炎症小体均有抑制作用。在LPS诱导的脓毒血症小鼠模型实验中,隐丹参酮和丹参酮Ⅰ均降低了LPS诱导脓毒血症模型小鼠的死亡率,确定隐丹参酮和丹参酮Ⅰ下一步实验的给药剂量均为20mg/kg。在LPS诱导脓毒血症小鼠模型中,隐丹参酮和丹参酮Ⅰ均降低了LPS诱导的血清和腹腔液中IL-1β的升高,而对TNF-α的蛋白表达无明显影响,同时降低了腹腔液中炎性细胞F4/80、中性粒细胞的比例,从而减少炎性细胞浸润。在MCD饮食诱导NASH小鼠模型实验中,隐丹参酮和丹参酮Ⅰ能改善模型小鼠的精神状态和活动情况。肝组织病理学检测结果显示隐丹参酮和丹参酮Ⅰ干预组较模型组小鼠肝组织脂肪空泡、炎性细胞浸润、肝组织胶原纤维明显减少;血清中ALT、AST水平降低（P<0.01）。表明隐丹参酮和丹参酮Ⅰ对肝损伤有改善作用。隐丹参酮干预组较模型组肝组织α-SMA、Col1a1、IL-1β、NLRP3 mRNA的表达下调（P<0.01）,肝组织中caspase-1 p20蛋白表达水平降低,血清IL-17A蛋白含量降低,全血免疫细胞辅助性T细胞Th17比例显著性降低（P<0.01）,而Treg调节细胞比例变化无显著性差异。结论:隐丹参酮和丹参酮Ⅰ均能特异性抑制NLRP3炎症小体的活化。隐丹参酮通过抑制NLRP3炎症小体活化过程中炎症小体的组装、钙离子流动以及线粒体活性氧的产生等发挥抗炎作用,而丹参酮Ⅰ通过抑制NLRP3炎症小体的组装来发挥抗炎作用。隐丹参酮和丹参酮Ⅰ均可通过它们的抗炎活性,发挥对脓毒血症小鼠和MCD饮食诱导的NASH小鼠的保护作用。综上,隐丹参酮和丹参酮Ⅰ是丹参靶向NLRP3炎症小体的抗炎活性成分,并对NLRP3炎症小体介导的炎性疾病具有保护作用,研究结果有助于阐明丹参的抗炎物质基础和具体机制,为丹参临床运用提供更为扎实的科学依据。