肝细胞癌（肝癌）是最常见的恶性肿瘤之一，在发展中国家有很高的发病率。尽管在过去的几十年里，肝癌的治疗效果有所提高，但由于肝癌起病隐匿，肝内转移较早和复发率较高，而且肝癌细胞对常用的抗肿瘤药物和放疗等治疗措施不敏感，导致肝癌的预后仍然很差。因此，进一步寻找和开发新的治疗策略是非常必要和急迫的。5-氟尿嘧啶（5-FU）是一种嘧啶类抗癌药物。自从被发现以来，5-FU在肿瘤化疗领域占据重要地位。尤其对恶性肿瘤非常有效，是多种癌症（如肝，胃，胰腺癌和乳腺癌）广泛使用的化疗药物，但肝癌细胞对5-FU不是特别敏感，因此如何提高肝癌细胞对5-FU的敏感性是非常重要的课题。姜黄素是从姜科植物姜黄中提取的一种色素。现代研究发现姜黄素的主要药理作用有抗氧化、抑制炎症反应及抑制肿瘤生长。近年来许多研究表明，人类的多种肿瘤如胃癌、大肠癌、乳腺癌、肝癌、肾癌的发病都与PI3K/AKT信号通路密切相关，PI3K/AKT信号通路不仅可以调节肿瘤细胞的凋亡，而且可以调节肿瘤微环境中多种细胞因子和炎症因子的表达，从而发挥对肿瘤细胞或组织的影响，而且最近研究发现，PI3K/AKT信号通路可以通过调控免疫细胞或免疫分子作用干预肿瘤的发生和发展。AKT又称蛋白激酶B（PKB），是PI3K/AKT信号通路中关键的信号分子，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在细胞存活和凋亡中发挥重要作用。PI3K属于胞内磷脂酰肌醇激酶家族成员，它能特异地使磷脂酰肌醇和磷酸肌醇上第3位羟基基团磷酸化。PTEN（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)，即人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因，为新发现的一种抑癌基因，位于第10号染色体q23.3，转录产物为515kb mRNA。PTEN属于PTP（protein tyrosine phosphatases）基因家族成员。PTEN基因可以调控肿瘤抑制因子的合成，通过阻止细胞过快的生长和分裂，进而调控细胞分裂周期。有证据显明，PTEN还具有协助控制细胞转移、细胞与周围组织的粘附和血管发生等功效。此外，PTEN还在维持细胞遗传信息的稳定性上具有重要作用。因而PTEN基因是众多肿瘤预后的评价指标，研究其作用机制对肿瘤的诊断及其基因治疗具有重要意义。Toll样受体（Toll-like receptors, TLR）是参与非特异性免疫的一类重要蛋白质分子，也是连接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁。TLR能够监视与识别各种不同的疾病相关分子模式（PAMP），是机体抵抗感染性疾病的第一道屏障。TLR是单个的跨膜非催化性蛋白质，可以识别来源于微生物的具有保守结构的分子。当微生物突破机体的物理屏障，如皮肤、粘膜等时，TLR可以识别它们并激活机体产生免疫细胞应答。其中TLR4不但可识别外源的病原体，还可识别内源性物质及降解物。新近研究发现，TLR能结合机体自身产生的一些内源性分子。免疫佐剂可增强抗肿瘤免疫，其分子和细胞机制得到进一步阐明，TLR也在其中扮演重要角色。由于肿瘤在发生发展过程中可以产生一些能被识别的内源性配体，所以TLR在肿瘤免疫监视中可能发挥了一定作用。TLR4可以识别革兰氏阴性菌脂多糖(LPS)，还可识别宿主坏死细胞释放的热休克蛋白(heat-shockproteins，HSP)，体内类肝素硫酸盐和透明质酸盐降解的多糖部分，以及局部的内源性酶的级联活化反应也可激活TLR4。近年研究显示TLR4在肿瘤的发生和发展中发挥重要的作用。本研究通过探讨抗肿瘤药物联合姜黄素对肝癌细胞的抑制作用和对PI3K/AKT信号通路及相关分子的影响，来阐明姜黄素对常用化疗药的增敏作用及其相关机制。目的：研究5-FU单用或联合姜黄素对HepG2细胞PI3K/AKT信号通路及相关调控分子AKT、PTEN和TLR4的影响。方法：实验分两部分。第一部分：5-FU单用或联合姜黄素对HepG2细胞PI3K/AKT信号通路及相关调控分子AKT、PTEN和TLR4的影响。选用HepG2肝癌细胞用于研究，体外培养HepG2细胞，取对数生长期细胞用于实验，将HepG2细胞接种在96孔板中，培养48小时后分别加入不同浓度的姜黄素5umol/L、10umol/L、20umol/L、40umol/L、50umol/L、60umol/L、80umol/L进行药物干预，培养24、48小时后行MTT检查，确定实验用姜黄素的浓度。分别应用5氟尿嘧啶单独或联合姜黄素作为药物组培养HepG2细胞，分别培养24小时和48小时，行MTT检查，了解5氟尿嘧啶单独或联合姜黄素对HepG2细胞生存率的影响，提取细胞总RNA和总蛋白，应用RT-PCR方法检测PTEN、AKT、TLR4mRNA的表达，western-blot方法检测PTEN、AKT蛋白的表达。第二部分：肝癌组织和肝硬化组织中PTEN、AKT、TLR4mRNA和PTEN、AKT蛋白表达：取肝癌组织和肝纤维化组织各10例，western-blot法检测PTEN、AKT蛋白的表达。提取肝癌组织和肝纤维化组织总RNA，RT-PCR方法检测PTEN、AKT、TLR4mRNA的表达。结果：1不同浓度姜黄素对HepG2细胞存活率的影响：MTT结果显示:在不同的时间点，不同浓度(5umol/L、10umol/L、20umol/L、40umol/L、50umol/L、60umol/L、80umol/L)的姜黄素均对细胞有抑制作用，且呈明显的时间和剂量依赖性。25-FU单用和联合姜黄素对HepG2细胞存活率的影响：MTT结果显示：在24、48小时两个时间点，单独使用5-FU（7.5umol/L）以及5-FU联合姜黄素对HepG2细胞均有抑制作用。且联合用药比单独用药抑制作用强，且干预时间愈久，抑制作用越强。35-FU单独和联合姜黄素对HepG2细胞中PTEN、AKT、TLR4的mRNA的影响：药物干预HepG2细胞24小时，5-FU组较对照组PTEN和TLR4的mRNA表达明显升高, AKTmRNA表达明显降低；姜黄素联合5-FU组较单用5-FU组PTEN和TLR4mRNA表达升高更加明显，AKTmRNA表达下降亦更加显著。与培养24小时结果比较，药物作用HepG2细胞48小时5-FU组PTEN和TLR4的mRNA的表达较24小时明显升高，AKTmRNA表达较24小时明显降低；姜黄素联合5-FU组较单用5-FU组上述表达趋势更加明显。各指标两组之间差异均有统计学意义（P<0.05）。45-FU单独和联合姜黄素对HepG2细胞中PTEN、AKT蛋白表达的影响：药物干预HepG2细胞24小时，5-FU组较对照组PTEN蛋白表达升高，AKT蛋白表达下降；姜黄素联合5-FU组较单用5-FU组上述趋势更加明显。药物干预48小时，5-FU单独或是姜黄素联合5-FU组PTEN蛋白升高和AKT蛋白下降较24小时趋势更加明显。各指标两组之间差异均有统计学意义（P<0.05）。5肝癌组织和肝硬化组织中PTEN、AKT、TLR4mRNA和PTEN、AKT、P-AKT蛋白表达：结果显示肝癌组织中的PTEN、AKT、TLR4mRNA和PTEN、AKT、P-AKT蛋白水平比肝硬化组织中上述指标升高，各指标两组之间有统计学意义（P<0.05）。结论：1姜黄素可以促进HepG2细胞的凋亡，随着浓度的增加和时间的延长促凋亡作用逐渐明显。联合5-FU的促凋亡作用更加明显。2姜黄素联合5-FU通过PI3K/AKT信号通路降低了AKT的水平而提高了PTEN、TLR4的水平，从而提高了抗肿瘤的作用。3在肝癌组织较肝硬化组织中PI3K/AKT信号通路活性增强。