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背景:胃癌是我国肿瘤相关死亡率位于第四的恶性肿瘤,其发病隐匿,一经发现多处于晚期。化疗是治疗晚期胃癌、提高患者生存率的主要手段,5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil,5-FU）是目前防治胃癌中应用最普遍的化疗方法之一,但耐药性的产生已经成为5-FU应用的主要障碍,探索胃癌耐药产生的机制并借此寻找逆转胃癌5-FU耐药的方法已成为当下研究的热点。本课题组前期研究发现,作为CD13抑制剂的乌苯美司与5-FU的协同作用,可增强5-FU在乳腺癌、肾癌和肝癌等肿瘤细胞中的抗肿瘤活性,还可通过靶向CD13上调由化疗药物诱发的细胞凋亡,改变肝癌细胞的耐药性。但是,作为唯一上市的CD13抑制剂,乌苯美司临床上仅被用作免疫增强剂辅助血液肿瘤的治疗,目前并未有关于乌苯美司逆转胃癌5-FU耐药性的报道。因此,本研究拟探讨乌苯美司逆转胃癌5-FU耐药的作用及其机制。方法:利用大剂量贯序冲击及体外低浓度梯度递增的方式构建5-FU耐药的胃癌细胞SGC-7901/5-FU。通过CCK-8实验测定乌苯美司（0.12 mg/ml）预处理前后,5-FU对胃癌耐药细胞增殖活性的影响。将SGC-7901/5-FU细胞用5-FU预处理后,利用蛋白免疫印迹法（Western blot）和免疫荧光技术检测不同浓度乌苯美司（0.06mg/ml,0.12 mg/ml）作用下自噬及凋亡相关蛋白的表达水平,通过透射电子显微镜观察乌苯美司作用前后细胞内自噬小体的数目,通过流式细胞术评价乌苯美司对5-FU介导的胃癌耐药细胞凋亡情况的影响。为进一步探究乌苯美司逆转耐药作用的分子机制,我们通过Affymetrix Clariom TM S基因芯片测序,分析乌苯美司作用前后,MKN-45/X细胞的m RNA表达变化;利用高内涵筛选（High content screening,HCS）实验、GO功能及KEGG通路富集分析,筛选乌苯美司逆转胃癌耐药的关键基因,通过Western blot检测确定关键基因蛋白表达及上下游调节关系。最后,构建过表达或沉默载体转染细胞,利用Western blot、免疫荧光、流式细胞术及CCK-8实验,评价细胞自噬及相关蛋白表达、细胞凋亡及相关蛋白表达、细胞对5-FU敏感性的变化,从而确定关键蛋白及调节轴在乌苯美司逆转胃癌5-FU耐药过程中的作用。结果:CCK-8结果显示乌苯美司预处理后SGC-7901/5-FU细胞对5-FU的敏感性明显增强,并呈现出时间-剂量依赖性;Western blot及免疫荧光的结果显示随着乌苯美司的浓度增加,SGC-7901/5-FU细胞内Beclin-1、ATG5、LC3B表达降低,P62的表达升高;并且通过透射电子显微镜发现经乌苯美司处理后的细胞中自噬小体数量明显增多,说明乌苯美司能够剂量依赖性的抑制SGC-7901/5-FU细胞自噬水平。流式细胞术、Western blot及免疫荧光实验结果显示,乌苯美司可以促进5-FU诱导的胃癌耐药细胞凋亡。基因芯片的结果显示,乌苯美司处理MKN-45/X细胞后能够引起包括CD13在内的264个基因表达下调,228个基因表达上调;利用HCS实验发现CD13/EMP3/FAK调节轴极可能在乌苯美司逆转耐药过程中发挥重要作用;GO功能及KEGG通路富集分析表明上述基因富集于NF-κB通路,且参与调控细胞自噬和凋亡。Western blot结果进一步证实,乌苯美司抑制SGC-7901/5-FU细胞中CD13、EMP3、FAK、NF-κB表达,并呈一定的剂量依赖性;当CD13过表达后能够逆转乌苯美司对这一系列通道蛋白的抑制作用,而EMP3过表达后对乌苯美司抑制CD13表达的能力无显著影响,但依旧能够逆转其他信号通路蛋白的表达;并且与对照组相比,CD13沉默组与乌苯美司处理组的通道蛋白表达水平具有相同的下调趋势,因此推断乌苯美司可以抑制SGC-7901/5-FU细胞中CD13/EMP3/FAK/NF-κB的通路活性。此外,乌苯美司处理组中SGC-7901/5-FU细胞的自噬水平降低、凋亡水平升高,然而重要的是,CD13过表达能够逆转乌苯美司对细胞自噬和凋亡的调节作用;免疫荧光实验结果同样证实乌苯美司可以抑制FAK的磷酸化水平,这种作用在CD13过表达后被抵消,由此可以证实乌苯美司靶向CD13/EMP3/FAK/NF-κB通路,调控细胞自噬和凋亡。CCK-8实验最终证实CD13/EMP3过表达后,乌苯美司增强胃癌耐药细胞对5-FU敏感性的作用被削弱,由此我们得出结果,乌苯美司抑制SGC-7901/5-FU细胞中CD13/EMP3/FAK/NF-κB通路活性,降低细胞自噬逆转5-FU耐药。结论:乌苯美司逆转SGC-7901/5-FU细胞对5-FU的耐药性,这是通过抑制自噬促进其诱导的细胞凋亡实现的,而这一作用的实现与乌苯美司抑制CD13/EMP3/FAK/NF-κB通路活性密不可分。本研究成果为乌苯美司用于胃癌化疗增敏提供了新方向和新思路,据此,乌苯美司和5-FU的联合应用或将成为胃癌治疗的新方案。