【摘 要】
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胚胎体外生产和冷冻保存技术在家畜种质资源保存方面有重要应用价值。近年来,随着动物转基因技术研究的不断推进,各种转基因动物育种新材料不断出现,部分转基因动物已经进入安全性评价阶段,转基因动物新品种培育在家畜种业创新领域具有重要应用价值。目前,所有转基因动物育种材料均在封闭性条件下饲养管理,建立一套转基因动物种质材料保存和利用方法,对促进转基因育种研究有重要意义。口蹄疫病毒的抗原表位大部分集中在VP1
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目（编号:31772689）；
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胚胎体外生产和冷冻保存技术在家畜种质资源保存方面有重要应用价值。近年来,随着动物转基因技术研究的不断推进,各种转基因动物育种新材料不断出现,部分转基因动物已经进入安全性评价阶段,转基因动物新品种培育在家畜种业创新领域具有重要应用价值。目前,所有转基因动物育种材料均在封闭性条件下饲养管理,建立一套转基因动物种质材料保存和利用方法,对促进转基因育种研究有重要意义。口蹄疫病毒的抗原表位大部分集中在VP1上,作为主要的免疫原性蛋白激发Th、B细胞产生免疫应答。本实验室课题组前期制备了转口蹄疫VP1基因奶山羊,本研究通过对转基因奶山羊后代羊进行PCR鉴定,筛选出转基因阳性后代,并验证外源基因在转基因公羊精液中的整合情况。利用转基因公羊精液进行体外受精,获得转基因胚胎,同时采用Cryotop玻璃化冷冻技术,通过对早期囊胚冷冻、解冻复苏的效率和继续培养发育后囊胚扩张率来筛选出玻璃化冷冻保护剂组分并进行优化,并对冷冻复苏后的胚胎质量进行检测,对比其与正常胚胎的囊胚总细胞数、滋养层细胞数（TE）、内细胞团数（ICM）和细胞凋亡情况,确定了适合转基因山羊精液体外受精和胚胎冷冻保存条件,用于转基因山羊胚胎资源的保存和利用。获得如下结果:1.对14只转基因奶山羊后代进行颈静脉采血提取山羊血液基因组进行PCR鉴定,其中8只奶山羊确定为转口蹄疫VP1基因奶山羊（OFMDV-VP1）,4只母羊,4只公羊,同时提取4只公羊精液基因组进行鉴定,精液中也整合有外源基因。2.通过电刺激采精法采集转基因公羊精液,利用Percoll法处理精液进行体外受精,获得体外胚胎,并进行PCR鉴定,确定转基因胚胎,继续培养,用于后续试验进行冷冻保存和胚胎移植。3.确定了采用Cryotop法以40%EG+0.5mol/L L?proline作为冷冻保护剂,可用于转基因山羊胚胎的冷冻保存,冷冻解冻后复苏率89.9%,囊胚扩张率74.5%。对比正常胚胎与冷冻解冻复苏胚胎的囊胚细胞总数、TE、ICM和凋亡细胞数,均差异不显著（P>0.05）。用冷冻后复苏的胚胎进行胚胎移植,母羊妊娠率为50%,可用于临床应用,为转基因羊胚胎资源的冷冻保存及生产应用提供帮助。
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