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背景和目的:冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary heart disease,CHD)目前仍居各种疾病致死原因的首位。经皮冠状动脉介入治疗(Percutaneous coronary intervention,PCI)的发展及优化药物治疗也只减少但并未能完全抑制负性心脏事件的发生。从稳定的动脉粥样硬化到急性心脏事件——急性冠脉综合征(acute coronary syndrome,ACS)的发生,其发生机制仍需深入研究。近年来研究提示肠道菌群在心脏代谢性疾病如糖尿病、代谢综合征、动脉粥样硬化中起到重要作用,但在ACS中的作用机制仍需进一步研究。肠道菌群为寄生于人体肠道黏膜表面的微生物群体,肠道黏膜作为人体与外界接触的防线,是人体最大的免疫活性器官之一,因此有多项研究表明肠道菌群组成的改变及其产生的代谢产物可与宿主的免疫系统相互作用,但是在ACS中肠道菌群是否可以通过免疫调节发挥作用尚不清楚。ACS发生包括复杂的炎症反应及免疫代谢失调过程,涉及多种免疫细胞及炎症介质,其中适应性免疫的标志性细胞CD4+T细胞因其可分化为不同细胞亚群受到广泛关注。研究表明ACS患者循环中CD4+T细胞极化状态发生改变,其中两种标志性的细胞亚群:辅助型T细胞-17(T helpers cells 17,Th17)及调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)存在比例失衡。因此,以CD4+T细胞极化为靶点,本研究对肠道菌群、免疫炎症反应及ACS三者之间的关联性进行了探究,第一部分旨在通过分析ACS患者肠道菌群组成特异性及CD4+T细胞极化状态,探究肠道菌群与CD4+T细胞亚群极化间的关联性,从而证明肠道菌群可能是通过对CD4+T细胞极化的调节来影响ACS的发生发展;第二部分对血浆代谢产物与CD4+T细胞极化情况的关联性进行分析,探究肠道菌群是否是通过代谢产物介导免疫失衡的发生;第三部分选取标志性代谢产物通过体外细胞实验验证其对于CD4+T细胞极化的影响及其作用机制。内容与方法:第一部分2017年10月至2018年10月根据纳入排除标准前瞻性选取100例ACS患者,50例稳定型心绞痛(Stable angina,SA)患者及50例冠脉造影证实冠脉正常的患者。留取患者粪便及血清标本,进行粪便16S rDNA肠道微生物检测,比较ACS患者与对照组之间是否存在肠道微生物组成差异。应用流式细胞仪检测CD4+T细胞亚组Treg以及Th17细胞比例,应用ELISA检测血清细胞因子白介素10(Interleukin-10,IL10)及白介素17A(Interleukin 17A,IL17A)水平。探究肠道菌群与ACS炎症反应之间的关联性及肠道菌群可能影响ACS发生的机制。第二部分从上述ACS、SA及正常对照组患者中按照2:1:1比例随机抽取40例患者,留取血清样本,应用液相色谱-质谱联用法(LC-MS)对外周血代谢产物进行分析,比较ACS患者与对照组相比是否存在代谢产物差异,探究肠道微生物代谢产物与ACS炎症反应间的关联性。第三部分通过体外实验验证肠道微生物代谢产物氧化三甲胺(Trimethylamine N-oxide,TMAO)对CD4+T细胞增殖分化的影响及其机制研究。原代分离CD4+T细胞,分别加入0μmol/l,50μmol/1,l00μmol/1,200μmol/l,300μmol/l,600μmol/l,900μmol/l TMAO,应用CCK8检测CD4+T细胞增殖活性变化,选取最佳实验浓度,并应用ELISA测定细胞因子IL-10及IL-17A的浓度,应用流式细胞仪检测CD4+T细胞向亚群Treg及Th17极化的情况,并用western blot检测Treg标志蛋白叉头翼状螺旋转录因子3(Forkhead box P3,FoxP3),Th17 标志性蛋白维甲酸相关孤核受体γt(Retinoid-related orphan nuclear receptor γt,RORyt),以及信号通路Akt/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)磷酸化表达情况。结果:第一部分与对照组相比,ACS患者布劳特氏菌属(0.13±0.11 vs.0.09±0.07 vs.0.06±0.03,P=0.011)及双歧杆菌属(0.12±0.1 vs.0.06±0.08 vs.0.02±0.01,P=0.02)丰度明显降低,而梭杆菌门(0.0029±0.005 vs.0.0005±0.001 vs.0.0004±0.0005,P=0.022)、肠球菌属(0.16±0.04 vs.0.02±0.005 vs.0.006±0.002,P=0.025)、魏斯氏菌属(0.13±0.04 vs.0.02±0.007 vs.0.006±0.003,P=0.03)、克雷伯菌属(0.042±0.02 vs.0.036±0.01 vs.0.01±0.004,P=0.04)等致病菌丰度明显升高。同时ACS患者中存在CD4+T细胞分化失衡,表现为 Th17 比例升高(3.1±1.7%vs.1.9±0.7%vs.1.6±0.9%,P<0.001),Treg比例降低(1.88±1.04%vs.2.9±1.35%vs.4.4±2.6%,P<0.001),因此 Treg/Th17 比值明显低于对照组,且Treg/Th17比例与差异菌属双歧杆菌属呈正相关(r=0.25,P=0.03),与肠球菌属(r=-0.35,P=0.001)、魏斯氏菌属(r=-0.3,P=0.007)及克雷伯菌属(r=-0.34,P=0.001)呈负相关。第二部分ACS患者血浆代谢产物与SCAD组及对照组相比存在明显差异,结果表明主要差异代谢产物为吲哚,L-犬尿氨酸(L-Kynurenine,Kyn)及TMAO,富集的代谢通路为色氨酸代谢通路及微生物相关代谢通路。同时研究表明以上三种代谢产物与CD4+T细胞极化失衡相关,吲哚与Treg(r=0.61,P<0.001)及Treg/Th17(r=0.476,P=0.008)呈正相关,而Kyn及TMAO均与Th17呈明显正相关(分别为r=0.445,P=0.045;r=0.491,P=0.03),与 Treg/Th17 呈负相关(分别为 r=-0.399,P=0.029;r=-0.411,P=0.024)。第三部分TMAO可促进CD4+T细胞炎性极化,表现为Treg水平下降,而Th17上升,Treg/Th17比例下降,与此趋势一致,Treg的标志性蛋白FoxP3表达下降,Th17的标志性蛋白RORyt表达升高。进一步对细胞内信号通路进行检测,结果表明Akt及mTOR磷酸化增强,可能为TMAO促进CD4+T细胞向Th17分化的分子机制。结论:1.ACS患者存在菌群失调及T细胞分化失衡,二者之间明显相关,提示肠道菌群影响ACS发生的作用机制可能是通过诱导T细胞分化失衡,Th17产生增加,而Treg分化减少。2.肠道菌群可能通过其代谢产物影响T细胞分化失衡,从而促进ACS中炎症反应的发生,标志性的代谢产物为吲哚,L-犬尿氨酸及氧化三甲胺。3.不同浓度的TMAO对CD4+T细胞增殖活性的影响不同,可诱导CD4+T细胞炎性极化,主要表现为炎性表型Th17分化增加,伴有炎症因子IL17释放增多,其可能作用机制是激活Akt/mTOR通路。