由于饮食习惯、生活环境以及遗传等因素,我国成为食管癌发病率和死亡率最高的国家。虽然手术、放疗和化疗广泛应用于食管癌的治疗,但食管癌治疗后的五年总生存率依然小于20%。因此,我们需要研究新的策略来治疗食管癌。研究发现当肿瘤直径生长到1-2 mm的时候,肿瘤的生长必须通过刺激新生血管的生成,来满足其对氧气和营养成分的需求。因此,通过抑制肿瘤新生血管的生成来抑制肿瘤的生长,成为当前另外一种肿瘤免疫治疗的新策略。目前已知的和肿瘤血管生成相关的因子有30多种,通过抑制相关的通路和因子来阻断肿瘤血管生成,也取得了一定的效果。2003年贝伐单抗(Bevacizumab)成为第一个被FDA批准的用于肿瘤血管生成抑制剂,随后抗血管生成单克隆抗体逐渐应用于临床。但是肿瘤血管生成的方式多样,信号通路复杂,使目前针对单一靶点的药物治疗效果非常有限。肿瘤免疫治疗是通过激发和增强机体抗肿瘤免疫应答,调动宿主的天然防御机制,从而达到控制和杀灭肿瘤细胞的一种新的治疗方法,逐渐成为继手术、放化疗之后又一种肿瘤治疗的重要手段。肿瘤组织新生血管的内皮细胞处于十分活跃的增殖状态,而正常组织血管内皮细胞一般处于静止状态。以肿瘤血管内皮细胞为靶点的主动免疫治疗,靶向肿瘤血管内皮细胞增殖的多个抗原,产生综合抑制肿瘤血管生成的效果。人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)是增殖旺盛的内皮细胞,高表达内皮细胞增殖的相关抗原,与体内增殖活跃的肿瘤血管内皮细胞表达一些相同的血管内皮细胞增殖相关抗原。以HUVEC细胞制备疫苗,靶向多个肿瘤血管增殖的相关抗原,产生综合抑制肿瘤血管生成的效果。本研究构建了人源化的NOD/SCID小鼠食管癌移植瘤模型,探讨HUVEC疫苗对人食管癌的抗肿瘤血管生成作用,为抗肿瘤血管生成免疫治疗提供依据。方法:1.通过对24只NOD/SCID小鼠眼眶后丛静脉取血,获得血清。利用ELISA法检测NOD/SCID小鼠外周血血清中Ig G蛋白含量,检测小鼠是否发生“免疫渗漏”现象,并利用标准曲线计算所有小鼠血清中的Ig G蛋白含量。2.利用密度梯度离心法分离出人外周血的单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC),然后对NOD/SCID小鼠腹腔注射PBMC(4×106个/只)进行免疫重建。4周之后,获得小鼠外周血,通过流式细胞仪检测小鼠外周血中人的CD45+T淋巴细胞表达情况。3.将免疫重建成功的小鼠随机分为2组,一组为PBMC+HUVEC组(n=8),在小鼠左侧腋窝淋巴结周围注射HUVEC疫苗进行免疫(5×106个/只),1次/周,一共5次,刺激机体免疫能力的增强;另外一组为PBMC组(n=8)小鼠注射PBS。未免疫重建的小鼠(n=8)作为空白对照组注射PBS。一共3组进行本次实验。4.对PBS组小鼠(n=8)、PBMC组(n=8)和PBMC+HUVEC组(n=8)小鼠分别在背部皮下接种人食管鳞癌细胞EC9706(6×106个/只),待成瘤之后隔天测量,观察肿瘤的大小,成瘤后测量至第28天处死,得到肿瘤组织,称重并拍照。分别取3组小鼠的血清用ELISA法进行抗HUVEC抗体效价检测,测量450 nm的OD值检测小鼠血清中抗肿瘤血管内皮细胞抗体生成情况。随后,通过血红蛋白测定实验,将小鼠肿瘤组织研磨,并利用试剂盒在540 nm检测肿瘤组织研磨物上清中血红蛋白的浓度;将小鼠肿瘤组织用中性甲醛固定,石蜡包块,然后利用免疫组织化学技术,孵育抗体CD31,然后用DAB显色液染色,检查肿瘤组织中CD31的表达,以检测肿瘤组织新生血管的生成情况。5.剥离小鼠脾脏组织,称重并拍照;将小鼠脾脏组织研磨,过滤并用红细胞裂解液裂解红细胞,淋巴细胞分离液分离得到淋巴细胞。通过流式细胞仪检测3组小鼠等质量脾脏组织中CD45+T淋巴细胞的表达情况。提取肿瘤组织的RNA,并用Q-PCR的方法测定肿瘤组织中VEGFR2和CD144基因的表达情况;提取肿瘤组织的蛋白,用Western blot检测肿瘤组织VEGFR2和CD144抗原的表达。运用Western blot检测3组小鼠血清中抗VEGFR2和CD144抗体的表达情况,以及ELISA法检测3组小鼠血清抗HUVEC抗体的能力,来探索HUVEC疫苗抑制肿瘤血管生成的原因。结果:1.通过ELISA试剂盒对小鼠外周血中的小鼠Ig G含量的检测,结合Curve Expert软件得到的标准曲线,计算得到小鼠外周血中的Ig G含量都小于2 ng/ml,远远小于1μg/ml的标准;所有小鼠在后天环境的饲养中未发生“免疫渗漏”。2.流式细胞术分析免疫重建4周小鼠外周血中CD45+T淋巴细胞的表达量,结果显示CD45+T淋巴细胞>0.1%,证明免疫重建成功。3.剥离小鼠肿瘤后称量,3组小鼠肿瘤组织的重量分别是PBS组>PBMC组>PBMC+HUVEC组(p<0.01);三组小鼠血清抗HUVEC抗体效价:PBS组<PBMC组<PBMC+HUVEC组(p<0.05);肿瘤组织血红蛋白含量:PBS组>PBMC组>PBMC+HUVEC组(p<0.05);免疫组化检测肿瘤组织切片肿瘤微血管密度:PBS组>PBMC组>PBMC+HUVEC组(p<0.05)。4.剥离小鼠脾脏后称量,3组小鼠脾脏组织的重量分别是PBS组<PBMC组<PBMC+HUVEC组(p<0.05);流式细胞术检测16周3组小鼠脾脏分离得到的淋巴细胞和外周血中CD45+T淋巴细胞表达量:PBS组<PBMC组<PBMC+HUVEC组(p<0.001)。5.Q-PCR检测肿瘤组织中CD144和VEGFR2基因的表达情况:PBS组>PBMC组>PBMC+HUVEC组(p<0.05);肿瘤组织提取蛋白检测VEGFR2和CD144的抗原表达情况:PBS组>PBMC组>PBMC+HUVEC组(p<0.05),血清中VEGFR2和CD144抗体的表达情况:PBS组<PBMC组<PBMC+HUVEC组(p<0.001);ELISA检测三组小鼠血清中的抗HUVEC抗体的抗性:PBS组<PBMC组<PBMC+HUVEC组(p<0.001)。结论:1.注射人PBMC后,NOD/SCID小鼠免疫重建成功;2.HUVEC疫苗通过抑制肿瘤新生血管的生成,达到抑制人食管癌移植瘤生长的作用。