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第一部分:过表达PIDD-C,过表达PIDD-CC和靶向沉默PIDD小鼠小胶质稳定转染细胞系电离辐射后激活状态和炎症因子表达的变化【目的】:建立稳定过表达PIDD-C,过表达PIDD-CC和靶向沉默PIDD的小胶质细胞系。探究调节PIDD后电离辐射所致炎症因子水平及小胶质细胞激活状态的变化。【方法】:(1)建立稳定过表达PIDD-C,过表达PIDD-CC和靶向沉默PIDD的小胶质细胞系:靶向沉默PIDD的慢病毒载体,过表达PIDD-C和过表达PIDD-CC的慢病毒载体,阴性对照慢病毒空载体,通过病毒感染的方法分别导入小胶质细胞系BV-2,通过嘌呤霉素(puromycin)筛选得到稳定过表达PIDD-C、过表达PIDD-CC和沉默PIDD的小胶质细胞株;(2)沉默PIDD小胶质细胞株,过表达PIDD-C和过表达PIDD-CC小胶质细胞株及阴性对照小胶质细胞株分别接受10 Gy电离辐射;(3)Real-time PCR,Western Blot方法检测放疗后不同时间点(3h,6h,24h,48h)空白对照组,沉默PIDD,过表达PIDD-C和过表达PIDD-CC及阴性对照小胶质细胞株中PIDD及炎症因子TNF-α,IL-1β的m RNA和蛋白表达量的变化。Western Blot方法检测电离辐射后24h各组细胞中凋亡相关蛋白(caspase-3,BAX,bcl-2,caspase-9,PARP1)表达的变化;(4)细胞免疫荧光实验观察电离辐射后各组小胶质细胞激活状态(Iba-1,F4/80),炎症因子(TNF-α)及凋亡蛋白的表达(caspase-3);(5)免疫共沉淀检测PIDD-C,PIDD-CC蛋白与NEMO蛋白的相互作用;(6)划痕实验及Transwell小室迁移实验观察电离辐射后各组小胶质细胞迁移能力的变化;(7)克隆形成实验检测PIDD基因对小胶质细胞放射敏感性的影响。(8)流式细胞术检测电离辐射后各组小胶质细胞凋亡的变化;(9)透射电子显微镜观察电离辐射后各组小胶质细胞超微结构的变化。【结果】(1)成功建立沉默PIDD,稳定过表达PIDD-C和过表达PIDD-CC及感染阴性对照病毒的BV-2小胶质细胞株。实验分为6组:(1)空白对照组(Control):不接受电离辐射的正常小胶质细胞;(2)单纯照射组(RT):仅接受10 Gy电离辐射的小胶质细胞;(3)阴性对照组(Lv-NC):感染阴性对照病毒并接受10Gy电离辐射;(4)沉默PIDD组(Lv-PIDD-ih):感染沉默PIDD慢病毒并接受10Gy电离辐射的小胶质细胞;(5)过表达PIDD-C组(Lv-PIDD-PIDD-C-oe):感染过表达PIDD-C慢病毒并接受10 Gy电离辐射的小胶质细胞;(6)过表达PIDD-CC组(Lv-PIDD-PIDD-CC-oe):感染过表达PIDD-CC基因慢病毒并接受10Gy电离辐射的小胶质细胞。(2)Real-time PCR及Western blot检测电离辐射后各组细胞中PIDD,炎症因子TNF-α,IL-1β的表达变化。实验结果显示:相较于RT组,沉默PIDD基因降低放疗后小胶质细胞中PIDD,TNF-α,IL-1β的表达水平;过表达PIDD-C基因放疗后PIDD-C和PIDD-CC的表达增高,但TNF-α,IL-1β的表达较RT组增高显著;过表达PIDD-CC基因使放疗后细胞中的PIDD-CC,TNF-α,IL-1β的表达增加。(3)Western blot检测显示10 Gy电离辐射后,RT组细胞,Lv-NC组细胞及Lv-PIDD-CC-oe组细胞中,caspase-3,BAX,caspase-9,PARP1的蛋白表达水平均较Control组显著增高(P<0.05),bcl-2蛋白表达水平较Control组显著降低。Lv-PIDD-ih组细胞中caspase-3,BAX,caspase-9,PARP1蛋白表达水平较RT组降低,且差异有统计学意义(P<0.05)。(4)细胞免疫荧光实验显示,RT组细胞,Lv-NC组细胞及Lv-PIDD-CC-oe组细胞接受电离辐射后Iba-1和caspase-3荧光表达量较Control组增高明显,Lv-PIDD-C-oe细胞F4/80,TNF-α表达明显增高,和而Lv-PIDD-ih细胞Iba-1和F4/80荧光表达量较Control组无明显差异。(5)划痕实验及Transwell小室迁移实验显示,电离辐射后RT组细胞,Lv-NC组细胞,Lv-PIDD-C-oe组细胞和Lv-PIDD-CC-oe组细胞迁移率较Control组细胞高,Lv-PIDD-C-oe组细胞迁移增加明显,差异具有统计学意义(P<0.05)。Lv-PIDD-ih细胞在电离辐射后迁移率与Control细胞无统计学差异。(6)克隆形成实验结果显示:小胶质细胞沉默PIDD后其放射敏感性降低,过表达PIDD-CC的小胶质细胞放疗敏感性增高(P<0.05)。(7)流式细胞术检测电离辐射后各组细胞凋亡的变化,结果显示:小胶质细胞在接受10 Gy电离辐射24h、48h后RT组,Lv-NC组和Lv-PIDD-CC-oe组凋亡细胞明显增多,LV-PIDD-ih组凋亡细胞比例较RT组低,差异具有统计学意义(P<0.05)。(8)透射电镜观察电离辐射后细胞亚结构,结果显示:照射后,RT组和Lv-PIDD-CC-oe组细胞次级溶酶体增多,可见高尔基体、内质网线粒体变形严重;Lv-PIDD-ih细胞,Lv-PIDD-C-oe组较RT组细胞次级溶酶体减少,初级溶酶体比例增加,内质网及线粒体变形减轻。【结论】沉默PIDD基因能够抑制电离辐射诱导小胶质细胞激活,减少炎症因子的释放,抑制小胶质细胞凋亡。过表达PIDD-C基因促进小胶质细胞电离辐射后激活,增加炎症因子释放。过表达PIDD-CC基因促进电离辐射后小胶质细胞的凋亡。免疫共沉淀显示PIDD-C和PIDD-CC两个片段均与NEMO之间存在相互作用。第二部分:慢病毒介导的过表达PIDD-C、过表达PIDD-CC和沉默PIDD对小鼠放射性脑损伤的影响【目的】:将高浓度滴度过表达PIDD-C过表达PIDD-CC的慢病毒颗粒和沉默PIDD的慢病毒颗粒注入小鼠侧脑室,构造过表达PIDD-C和过表达PIDD-CC及沉默PIDD的小鼠模型。小鼠10 Gy电离辐射后,比较各组小鼠脑组织中PIDD和炎症因子(TNF-α,IL-1β)的变化,以及脑组织中小胶质细胞的激活状态,和小鼠学习记忆能力的改变,进一步探讨PIDD基因对小鼠放射性脑损伤的影响。【方法】:(1)60只C57BL/6J小鼠随机分为6组,每组10只。分别为:(1)Control(正常对照)组;(2)RT(单纯照射)组;(3)Lv-NC(空载体)组;(4)Lv-PIDD-ih(沉默PIDD)组;(5)Lv-PIDD-C-oe(PIDD-C过表达)组;(6)Lv-PIDD-CC-oe(PIDD-CC过表达)组;(2)采用小鼠脑立体点位技术,将高浓度滴度过表达PIDD-C,过表达PIDD-CC和沉默PIDD基因的慢病毒颗粒微量注射入小鼠侧脑室,手术5天后给予(2)-(6)组10 Gy全脑放疗,取放疗后不同时间点(3h,6h,24h,48h,72h,1w,4w)小鼠脑组织,采用Real-time PCR,Western blot实验检测放疗后不同时间点小鼠脑组织中PIDD,炎症因子TNF-α,IL-1β的m RNA和蛋白的变化;(3)Western blot检测放疗后各组小鼠脑组织中凋亡相关蛋白(caspase-3,BAX,bcl-2,PARP1)的表达变化;(4)组织免疫荧光双染,观察电离辐射后各组小鼠脑组织中小胶质细胞激活状态及凋亡状态的表达(Iba-1,F4/80,PIDD,TNF-α,caspase-3);(5)放疗后6周各组小鼠7只,进行Morris水迷宫实验,检测各组小鼠接受10 Gy全脑放疗后学习和空间记忆能力的改变。【结果】(1)成功建立沉默PIDD和过表达PIDD-C,过表达PIDD-CC基因的小鼠放射性脑损伤模型,空白对照组为Control组,单纯照射组为RT组,阴性对照慢病毒空载体感染组为Lv-NC组,沉默PIDD基因感染组为Lv-PIDD-ih组,过表达PIDD-C慢病毒感染组为Lv-PIDD-C-oe组,过表达PIDD-CC慢病毒感染组Lv-PIDD-CC-oe组。小鼠接受10Gy电离辐射后,Western Blot结果显示:Lv-PIDD-C-oe组PIDD-C蛋白表达明显高于Control组(P<0.05),LV-PIDD-CC-oe组PIDD-CC蛋白表达明显高于Control组(P<0.05)。LV-PIDD-ih组小鼠脑组织中PIDD蛋白表达量明显低于其余各组(P<0.05),与Control组无显著差异。(2)Real-time PCR及Western blot方法检测放疗后各组小鼠脑组织中炎症因子TNF-α,IL-1β的表达变化。实验结果显示:各组炎症因子的表达在放疗后随时间的变化而变化,RT组,Lv-NC组,Lv-PIDD-C-oe组及Lv-PIDD-CC-oe组脑组织中TNF-α表达量在放疗后3h达到最高,IL-1β6h达高峰,Lv-PIDD-C-oe组中炎症因子的表达较Lv-PIDD-CC-oe组高,且差异有统计学意义(P<0.05)。(3)Western blot检测显示10 Gy电离辐射后,RT组,Lv-NC组及Lv-PIDD-CC-oe组中,caspase-3,BAX,caspase-9,PARP1的蛋白表达水平均较Control组显著增高(P<0.05),bcl-2蛋白表达水平较Control组显著降低。Lv-PIDD-ih组脑组织中caspase-3,BAX,caspase-9,PARP1蛋白表达水平较RT组降低,且差异有统计学意义(P<0.05)。(4)组织免疫荧光实验显示,RT组,Lv-NC组及Lv-PIDD-CC-oe组接受电离辐射后Iba-1和F4/80,TNF-α和caspase-3阳性细胞数较Control组增高明显,而Lv-PIDD-ih和Lv-PIDD-C-oe组脑组织中Iba-1和F4/80阳性细胞数较Control组无明显差异。Morris水迷宫实验显示,沉默PIDD和过表达PIDD-C能够改善放射性脑损伤后小鼠的记忆能力。【结论】沉默PIDD表达可通过抑制电离辐射NF-κB信号通路激活,进而抑制小胶质细胞的激活,减少炎症因子的释放,故有可能可以成为治疗放射性脑损伤的新靶点。