背景和目的肿瘤、外伤及炎症等多种疾病均可导致骨缺损,如何有效地促进骨修复一直是医学研究的热点。随着基因工程技术的发展,以干细胞为载体的基因疗法为修复各种原因导致的骨缺损提供了新的治疗手段,成为骨缺损修复的研究热点。骨髓间充质干细胞(BMSCs)因其强大的增殖及多分化潜能,已成为组织工程研究的种子细胞。如何促进BMSCs高效地向成骨细胞方向分化是目前骨组织工程丞待解决的关键问题。虽然已有许多关于诱导BMSCs成骨分化的研究报道,但仍有许多不足之处,如增加感染、癌症的风险等,因此仍需继续研究新的、有效的促进成骨分化的方法。一氧化碳释放分子(CORMs)是一类携带并可控性释放一氧化碳(CO)的羰基化合物,具有抗炎、改善血管功能、抗凋亡、心脏保护等多种作用。我们课题组前期主要围绕CORMs的抗炎特性进行了体内、外实验研究,发现CORMs对牙周炎有抑制作用。牙周炎的两个主要特征为炎症和牙槽骨吸收破坏。CORMs能否促进骨再生呢?CORMs对间充质干细胞成骨分化有何影响?目前尚未见公开报道。在前期人牙周膜细胞实验中我们发现,CORM-3刺激可引起细胞血红素氧合酶-1(HO-1)的高表达。学者在大鼠脑星形胶质细胞等其它细胞中也发现了CORMs引起HO-1高表达的情况。HO-1高表达能够促进间充质干细胞成骨分化,由此我们推测CORMs或许能够促进BMSCs成骨分化。在针对CORMs生理效能研究的同时,相关机制研究不断深入,最近的研究还涉及到了 microRNA,发现CORMs可引起细胞在microRNA水平发生变化,并最终调节或改善细胞功能状态。microRNA是一种约22nt大小的内源性非编码RNA,通过结合靶基因mRNA诱导其降解或抑制其翻译,参与生命过程中一系列的重要进程。microRNA-20b可通过抑制PPARy等激活BMPs/Runx2信号通路,促进BMSCs成骨分化。体内敲除Dicer酶后,microRNA消失,最终可导致小鼠肢体发育障碍,这些结果提示适当水平的microRNA表达对于干细胞成骨分化是必不可少的。课题组前期对CORM-3刺激后的人牙周膜细胞进行基因测序的结果显示:CORM-3能够引起人牙周膜细胞microRNA差异性表达,使部分microRNA表达上调、部分microRNA表达下调。鉴于人与大鼠基因高度同源,我们推测CORM-3很可能会引起大鼠BMSCs microRNA的差异性表达。基于以上研究背景,本实验首先以大鼠BMSCs为体外实验模型,研究CORM-3对BMSCs成骨分化的影响,同时以大鼠下颌牙槽骨缺损为体内实验模型,研究CORM-3诱导BMSCs对骨缺损修复的影响,进而在此基础上探讨microRNA在此过程中的作用机制,以期为骨缺损的修复提供新的思路及理论基础。方法1.大鼠BMSCs的分离培养和鉴定采用全骨髓法分离、培养Wistar大鼠BMSCs,取第3代BMSCs行成骨诱导、成脂诱导,分别以茜素红染色、油红O染色进行鉴定;采用流式细胞法对BMSCs表面标记分子CD34、CD44、CD45、CD90进行鉴定;BMSCs以低密度接种进行克隆形成实验,结晶紫染色观察结果。2.CORM-3对BMSCs活性与增殖的影响BMSCs分别于100、200、400及800μM的CORM-3培养液培养24h后,以CCK-8法检测不同浓度CORM-3对BMSCs活性的影响。BMSCs分别于100、200、400μM的CORM-3培养液培养1天、3天、5天及7天后,CCK-8法检测不同浓度CORM-3对BMSCs增殖的影响。3.CORM-3对大鼠BMSCs成骨分化的影响首先初步研究不同浓度CORM-3对BMSCs成骨分化的影响。将BMSCs分别于100、200、400μM CORM-3培养液培养24h后,换为成骨诱导液培养,7天后检测细胞内Runx2、OPN的mRNA与蛋白表达水平。选取200μM作为工作浓度,展开CORM-3对BMSCs成骨分化影响的研究。BMSCs分5组培养,CORM-3-矿化组:200μM的CORM-3培养液预处理24h后,换为成骨诱导液;矿化组:成骨诱导液培养;失活CORM-3-矿化组:200μM的失活CORM-3培养液预处理24h后,换为成骨诱导液;CORM-3组:200μM的CORM-3培养液培养;对照组:10%α-MEM培养液培养。分别于3、5和7天后,以RT-qPCR法检测各组中成骨相关因子Runx2、OCN及OPN的mRNA表达水平,采用罗氏light480 PCR仪软件进行数据分析;同时以WB法检测各组中Runx2、OCN及OPN的蛋白表达水平,并采用Image J软件进行灰度值分析。分别于3、5和7天后,使用碱性磷酸酶试剂盒检测各组ALP活性,进行统计分析。培养21天后进行茜素红染色,观察各组染色的大体情况,并用CPC溶解染料,562nm波长处测OD值,进行半定量分析。4.CORM-3诱导BMSCs对大鼠下颌牙槽骨缺损修复的影响于Wistar大鼠下颌左侧第一磨牙牙根与第二磨牙近中根的颊侧骨面制备牙槽骨缺损模型,实验分组如下:A组:骨缺损区植入载有BMSCs的胶原膜,术后腹腔注射CORM-3溶液;B组:骨缺损区植入胶原膜,术后腹腔注射CORM-3溶液;C组:骨缺损区植入载有BMSCs的胶原膜,术后腹腔注射0.9%氯化钠注射液;D组:骨缺损区植入胶原膜,术后腹腔注射0.9%氯化钠注射液。术后3周取材,行microCT扫描、HE染色及Runx2免疫组化染色,观察各组新骨形成情况,使用 Evaluation V6.5-3、Image-Pro-Plus 6.0、GraphPad Prism 5 V5.01 软件进行测量分析。5.CORM-3对BMSCs 4种microRNA表达水平的影响BMSCs于200μM CORM-3的成骨诱导培养基培养24h后,以RT-qPCR法检测细胞内 microRNA-212-3p、microRNA-132-3p、microRNA-199-5p 与microRNA-195-5p的表达水平,采用罗氏light480 PCR仪软件进行数据分析。6.microRNA-195-5p在CORM-3促进BMSCs成骨分化过程的作用通过瞬时转染的方法使细胞内microRNA-195-5p表达水平升高或下降。实验分为mimics、inhibitor两部分。mimics部分细胞分5组:矿化组:BMSCs于成骨诱导培养基培养;CORM-3+矿化组:BMSCs于含200μM CORM-3的成骨诱导培养基培养;mimics 组:microRNA-195-5p mimics 转染 BMSCs 24h 后,更换为200μM CORM-3的成骨诱导培养基培养;mimics NC组:mimics NC转染BMSCs 24h后,更换为200μM CORM-3的成骨诱导培养基培养;对照组:BMSCs于10%α-MEM培养液培养。inhibitor部分细胞分5组,其中inhibitor组为:microRNA-195-5p inhibitor 转染 BMSCs 24h 后,更换为 200μM CORM-3 的成骨诱导培养基培养;inhibitor NC组:inhibitor NC转染BMSCs 24h后,更换为200μM CORM-3的成骨诱导培养基培养,其它三组与mimics部分相同。3天和7天时采用RT-qPCR法检测各组Runx2、OPN mRNA表达水平的变化;同时采用WB法检测3天和7天时各组Runx2、OPN蛋白表达水平的变化,并采用Image J软件进行灰度值分析。14天时采用茜素红染色法观察各组矿化情况,并进行半定量分析。7.microRNA-195-5p 靶基因验证首先通过生物信息学软件预测,结合文献分析,选取靶基因Wnt3a进行后续研究;然后通过瞬时转染的方法使细胞内microRNA-195-5p表达水平升高或下降,48h后检测细胞内Wnt3a蛋白的表达水平,并采用Image J软件进行灰度值分析;同时结合双荧光素酶报告实验进行靶基因验证。8.Wnt3a在CORM-3促进BMSCs成骨分化过程中的作用首先以WB法检测CORM-3促BMSCs成骨分化过程中Wnt3a蛋白表达情况,并统计分析。通过瞬时转染的方法使细胞内Wnt3a表达水平升高或下降,实验分为Wnt3a过表达、沉默两部分。Wnt3a过表达部分分4组:CORM-3+矿化组:含200μM CORM-3的成骨诱导培养基培养;过表达组:Wnt3a过表达载体转染细胞24h后,换为200μM CORM-3的成骨诱导培养基培养;NC组:空载体转染细胞24h后,换为200μM CORM-3的成骨诱导培养基培养;对照组:10%α-MEM培养液培养。Wnt3a沉默部分4分组:沉默组:Wnt3a siRNA-493转染细胞24h后,换为200μM CORM-3的成骨诱导培养基培养;NC组:siRNA NC转染细胞24h后,换为200μM CORM-3的成骨诱导培养基培养;其它两组与过表达部分相同。3天和7天时采用RT-qPCR法、WB法分别检测各组Runx2、OPN的mRNA与蛋白的表达水平,并分析。14天时采用茜素红染色法观察各组矿化情况,并进行半定量分析。9.过表达靶基因的挽救实验通过瞬时转染的方法共转染miRNA-195-5p mimics与Wnt3a过表达载体,3天和7天时采用RT-qPCR法、WB法分别检测各组Runx2、OPN的mRNA与蛋白的表达水平,并分析。14天时采用茜素红染色法观察各组矿化情况,并进行半定量分析。结果1.大鼠BMSCs的分离培养和鉴定采用全骨髓法培养的BMSCs至第3代时细胞形态一致,以梭形为主。取第3代BMSCs行表面标记分子鉴定,CD90、CD44阳性率分别为98.4%、92.1%,CD45、CD34表达阳性率仅为0.2%、0.1%,符合大鼠BMSCs的表型特征。BMSCs成骨诱导培养21天后,经茜素红染色后,见钙结节生成;成脂诱导培养21天后,经油红O染色后,见脂滴生成,说明细胞具有多分化潜能。BMSCs低密度接种,培养10天后结晶紫染色,可见多个克隆形成。2.CORM-3对BMSCs活性与增殖的影响CCK-8检测结果显示:与对照组相比,CORM-3浓度在800μM时,OD值明显下降(P<0.05),CORM-3浓度在100、200、400μM时,其OD值均升高,以200μM组的OD值最高,差异有统计学意义(P<0.05),提示0-400μM为CORM-3对BMSCs的安全浓度范围。100、200、400μM CORM-3在1天、3天、5天及7天各时间点对BMSCs的增殖无显著影响。3.CORM-3对BMSCs成骨分化的影响分别以100、200、400μM CORM-3预处理细胞后再行矿化诱导,7天后以200μM CORM-3促进BMSCs成骨相关因子Runx2、OPN的mRNA与蛋白表达水平升高的效果最为明显,选取200μM作为后续实验的工作浓度。在3、5和7天时,CORM-3-矿化组Runx2、OCN、OPN mRNA表达水平与矿化组相比,均显著增强(P<0.05)。3、5和7天时,CORM-3-矿化组Runx2、OPN蛋白表达水平与矿化组相比,均显著增强(P<0.05);3天时各组中均未见明显的OCN蛋白表达,随着时间延长,OCN蛋白表达逐渐增强,5和7天时,CORM-3-矿化组OCN蛋白表达水平均显著高于矿化组(P<0.05)。CORM-3-矿化组细胞的ALP活性在3天后即迅速升高,且随着时间延长,活性持续在升高,而矿化组的ALP活性仅在7天时才开始升高。在3、5、7天时CORM-3-矿化组的ALP活性均显著高于而矿化组(P<0.05)。21天后CORM-3-矿化组茜素红染色颜色最深、浓,半定量分析显示:CORM-3-矿化组的OD值显著高于矿化组(P<0.05)。所有失活CORM-3-矿化组的数据与矿化组相比,差异均无统计学意义(P>0.05)。4.CORM-3诱导BMSCs对大鼠下颌牙槽骨缺损修复的影响术后3周取材行micro-CT扫描,三维重建后立体图像及冠状面图像结果显示:A组骨缺损区有更多新骨形成。A组的骨体积分数、骨小梁数目显著高于其它各组,差异均有统计学意义(P<0.05)。A组的骨小梁分离度显著低于其它各组,差异均有统计学意义(P<0.05)。HE染色显示,A组骨缺损区边缘见大块新生骨,B、C组骨缺损区边缘见少许新生骨,D组骨缺损区边缘散在少许的浅红色类骨质,未见明显新生骨。A组的新生骨面积比显著高于其他各组,差异均有统计学意义(P<0.05)。Runx2免疫组化染色显示,A组阳性细胞数量最多,其平均光密度值显著高于其它各组,差异有统计学意义(P<0.05)。5.CORM-3对BMSCs 4种microRNA表达水平的影响BMSCs在200μM CORM-3的成骨诱导培养基中培养24h后,mRNA-212-3p、miRNA-132-3p的表达水平显著升高,miRNA-199-5p、miRNA-195-5p的表达水平显著下降,差异均有统计学意义(P<0.05)。选取microRNA-195-5p进行后续实验。6.miRNA-195-5p在CORM-3促进BMSCs成骨分化过程的作用miRNA-195-5p表达水平降低后,3天和7天时BMSCs Runx2、OPN的mRNA与蛋白表达水平以及14天时的矿化能力均显著增强(P<0.05);而miRNA-195-5p表达水平升高后,得到相反的结果。另外mimics组7天时OPN的mRNA表达以及14天时的矿化能力与对照组相比,均显著增强(P<0.05)。7.microRNA-195-5p靶基因验证miRNA-195-5p mimics转染BMSCs 48h后,Wnt3a蛋白表达水平显著下降;miRNA-195-5p inhibitor转染后得到相反的结果。双荧光素酶报告实验中,miRNA-195-5p mimics与Wnt3a-3’UTR野生型质粒共转染后,荧光素酶活性下降19%,差异有统计学意义(P<0.05),而将Wnt3a-3’UTR区突变后的质粒与miRNA-195-5p mimics共转,其荧光素酶活性较野生型质粒组提高12%,差异有统计学意义(P<0.05)。8.Wnt3a在CORM-3促进BMSCs成骨分化过程中的作用CORM-3促BMSCs成骨分化过程中Wnt3a蛋白表达水平显著升高。以瞬时转染的方法使Wnt3a蛋白表达水平升高后,3天和7天时BMSCs Runx2、OPN的mRNA与蛋白表达水平以及14天时的矿化能力均显著增强(P<0.05);而Wnt3a蛋白表达水平降低后,得到相反的结果。9.表达靶基因的挽救实验miRNA-195-5p mimics与过表达Wnt3a载体共转染,3天、7天后细胞内Runx2、OPN的mRNA与蛋白表达水平回升,与CORM-3+矿化组持平或略高于CORM-3+矿化组;14天后共转染组的矿化能力稍弱于CORM-3+矿化组,但半定量分析显示差异无统计学意义(P>0.05),共转染较单独mimics转染时矿化能力明显增强。结论1.200μM CORM-3能够促进大鼠BMSCs成骨分化,并且该作用是由CORM-3释放的CO介导的。2.CORM-3诱导BMSCs促进了大鼠下颌牙槽骨缺损的修复。3.microRNA-195-5p靶向Wnt3a调控CORM-3促进BMSCs成骨分化的过程。在此过程中microRNA-195-5p表达下调,具有负调控作用;Wnt3a蛋白表达水平升高,具有正调控作用。创新及意义本课题以大鼠BMSCs作为体外实验模型,通过对CORM-3刺激细胞后成骨相关指标的研究,我们首次报道了CORM-3能够促进大鼠BMSCs成骨分化,并且该作用是由CORM-3释放的CO介导的。以大鼠下颌牙槽骨缺损为体内实验模型,通过对CORM-3诱导BMSCs后新骨形成情况的研究,我们首次报道了 CORM-3诱导BMSCs能够促进大鼠下颌牙槽骨缺损的修复,为骨缺损的治疗提供了新的思路,也为后期进行牙周炎条件下牙槽骨缺损修复的研究奠定了实验基础。在体内、外研究的基础上结合前期基因测序的结果,展开进一步的机制研究,首次报道microRNA-195-5p靶向Wnt3a调控CORM-3促进BMSCs成骨分化的过程。在此过程中microRNA-195-5p表达下调,具有负调控作用;Wnt3a蛋白表达升高,具有正调控作用,从分子生物学水平为骨缺损的治疗提供了新的分子靶点及理论基础。