巴贝西虫核酸等温扩增快速检测方法的建立

来源 :泰山医学院 | 被引量 : 0次 | 上传用户:xieming15898575325
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目的:
  巴贝西虫(Babesia)是专性寄生于哺乳动物的红细胞内的寄生性原虫,可经输血传播导致巴贝西虫病。经输血传播的巴贝西虫亚型主要有微小巴贝西虫、分歧巴贝西虫、邓肯巴贝西虫,目前在我国没有针对巴贝西虫感染的常规检测方法,为此采用具有自主知识产权的分子信标介导的恒温扩增技术和通用型核酸层析检测方法相对接,利用分子信标的高特异性和结果读取的可视化特性研制出一种可应用于即时检验(point-of-care technology,POCT)中的省时、高效、易操作的核酸检测方法来检测巴贝西虫。
  方法:
  首先在Genebank中查找该虫对人致病的基因序列,从中设计和筛选构象合适的Beacon环及相应的引物等,进行反应体系的优化然后先对人工合成的模板序列进行等温扩增,考察其灵敏度、特异性等然后再用质粒对其进行验证,扩增后的样本加入到试纸条上,在规定的时间内读取结果,观察所建立的快速等温扩增方法的特异性和灵敏度。
  结果:
  首先确定了Beacon最佳的反应浓度为50pM,然后对反应体系进行了优化,确定了primer反应的最佳浓度为5nM,最佳的反应温度为37℃,最佳的温育时间为30min,最佳的Mg2+浓度为15mM,最佳的DMSO反应剂量为1.2μL,然后利用优化后的反应体系与筛选出的扩增效率最高的Beacon环对模板的检测灵敏度下限约在50pM;且与其他几个经输血传播的相近物种无交叉反应,特异性良好。最后用构建的巴贝西虫质粒也能被成功检测。
  结论:
  针对经输血传播的多种巴贝西虫亚型基因组保守序列设计了通用型分子信标,并对其反应条件进行了一系列的优化,建立了分子信标介导的等温扩增方法检测巴贝西虫。在保持较高扩增效率的基础之上,该方法显示出良好的特异性,相比镜检等常规检测方法,本论文构建的方法缩短了分析时间、摆脱了对精密仪器设备和高素质的专业人员的依赖,可用于快速即时检测。
  意义:
  针对应急采集血液新发突发传染病检测检定技术上的不足,通过技术集成和创新,发展出有即时检验潜力、分子信标介导的等温扩增方法,有可能填补区域性血液安全保障技术与装置缺项,进一步提升应急采集血液的安全性。
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