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肺癌是当前对人类健康和生命危害最大的恶性肿瘤之一,发病率一直在不断上升,并已成为目前人类癌症死亡的主要原因,五年生存率约为15%。肺癌包括非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)和小细胞肺癌(small cell lung caner,SCLC),其中,非小细胞肺癌(NSCLC)约占肺癌的85%。非小细胞肺癌主要包括鳞癌(Squamous cell carcinoma,SCC和腺癌(adenocarcinoma, ADC).目前,肺癌的治疗手段主要包括手术、放疗、化疗、生物免疫治疗等,虽然肺癌的治疗手段较以前有了很大的提高,但是临床就诊的NSCLC中,绝大部分已属于中晚期,失去治疗的最佳时机,因此,积极寻找有效治疗NSCLC的新方法是临床上急需解决的难题。随着分子生物学和分子遗传学的深入研究,对肺癌的病因和发生机制也有了更深的认识,肺癌的发生和其他肿瘤一样,其实质是基因异常的结果。许多致癌因素均可通过激活原癌基因和／或失活抑癌基因而使细胞发生转化和癌变。因此,基因治疗越来越受到肿瘤学家的关注。而如何选取高效的基因治疗的靶点成了又一难题。RB94基因为野生型RB110的N末端缺失112个氨基酸残基,编码分子量为94KD的抑癌蛋白,比RB110表现出更强的抑癌作用。且不易被磷酸化,半衰期长,在细胞内较稳定存在。据文献报道,腺病毒介导的RB94基因感染头颈部癌,膀胱癌及前列腺癌细胞系及体内肿瘤均表现出显著的肿瘤抑制效应。而且,RB94基因联合放疗能够协同抑制头颈部肿瘤和肺癌细胞的生长。因此,RB94基因也许能成为有效治疗非小细胞肺癌的基因靶点。前期课题组成员构建了含有RB94基因的质粒pIRES-RB94,转染肺腺癌A549细胞和肺腺癌裸鼠皮下移植瘤,研究发现,RB94基因无论对肺腺癌A549细胞系还是裸鼠移植瘤均具有明显的肿瘤抑制作用。鞘氨醇激酶(sphingosine kinase,SphK)能够催化鞘氨醇(sphingomyelin, SP)生成1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate,S1P),鞘氨醇激酶含有SphK1和SphK2两个亚基。SphK1能够促进肿瘤细胞生长,抑制细胞的凋亡；SphK2与SphK1作用相反,能够抑制细胞生长,促进细胞凋亡。RB94基因可以抑制鞘氨醇激酶1 (sphingosine kinase1, SphK1)的表达、增强鞘氨醇激酶2 (sphingosine kinase 2, SphK2)的表达,推测RB94基因对肿瘤的抑制作用可能通过鞘氨醇激酶的作用,干预Sphk1/S1P通路,使鞘磷脂的代谢通路作为肿瘤治疗的靶点。本课题拟在前期研究的基础上,利用gateway技术构建携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的含有RB94基因的重组腺病毒载体Ad-RB94,进一步利用含有RB94基因的腺病毒载体感染肺腺癌A549细胞和人肺腺癌细胞系A549裸鼠皮下移植瘤,分别在细胞水平和动物水平研究RB94基因在非小细胞肺癌治疗中的作用及机制。本课题分为三大部分。第一部分：利用gateway技术构建含有RB94基因的重组腺病毒载体Ad-RB94;第二部分：RB94基因对人肺腺癌A549细胞周期调控作用及SphKs表达的影响；第三部分：RB94基因对肺腺癌裸鼠皮下移植瘤的生长抑制作用及SphKs表达的影响。第一部分利用Gateway技术构建含有RB94基因的重组腺病毒载体目的：获得RB94基因,构建携带绿色荧光蛋白(GFP)的人RB94基因的重组腺病毒载体Ad-RB94,为下一步在细胞和动物水平研究RB94基因奠定基础。方法：运用PCR方法扩增目的基因RB94全长,设计含有attB侧翼序列引物,用于重组片段的PCR扩增,利用Gateway技术,在BP重组酶的作用下,将含attB位点的PCR产物与带有绿色荧光蛋白(GFP)的载体发生重组反应。在LR重组酶作用下,将携带目的基因及绿色荧光蛋白的载体与带attR1、attR2位点的载体Ad/CMV/V5-DEST体外重组形成腺病毒载体Ad-RB94。经PCR和测序鉴定,将Ad-RB94线性化后转入293A细胞进行病毒的包装、扩增及病毒滴度测定。结果：经酶切及基因测序鉴定证实重组腺病毒载体Ad-RB94构建成功。携带绿色荧光的腺病毒载体Ad-RB94在293细胞中包装成功,在荧光显微镜下,可以观察到转染细胞中的绿色荧光,获得高滴度的病毒颗粒,病毒滴度可达2×109pfu/ml。结论：本实验利用Gateway技术成功构建重组腺病毒Ad-RB94,为下一步在细胞和动物水平进行肿瘤基因治疗研究奠定了实验基础。第二部分RB94基因对人肺腺癌A549细胞作用的实验研究目的：研究RB94基因对人肺腺癌A549细胞周期调控作用及SphKs表达的影响。方法：利用Gateway技术成功构建的重组腺病毒载体Ad-RB94感染肺腺癌细胞株A549,GFP检测转染效率,RT-PCR、Westernblot技术检测感染A549细胞前后RB94基因的mRNA和蛋白水平变化；流式细胞仪(FCM)分析细胞周期；RT-PCR和细胞免疫荧光测定重组腺病毒Ad-RB94感染A549细胞前后RB94基因对A549细胞中SphKs基因含量的影响。结果：流式细胞仪测定结果显示：与空白对照组和空载体组相比,感染腺病毒Ad-RB94组,G2/M期细胞数目增加,而G0/G1和S期细胞数目减少,Real timePCR和细胞免疫荧光均显示：RB94基因能够抑制SphKl表达、增强SphK2表达。结论：RB94基因可使阻滞于G2/M期细胞数目增加。同时,RB94基因可抑制A549细胞中SphKl的表达、增强SphK2的表达。第二部分RB94基因对人肺腺癌A549细胞作用的实验研究目的：研究RB94基因对人肺腺癌A549细胞周期调控作用及SphKs表达的影响。方法：利用Gateway技术成功构建的重组腺病毒载体Ad-RB94感染肺腺癌细胞株A549,GFP检测转染效率,RT-PCR、Westernblot技术检测感染A549细胞前后RB94基因的mRNA和蛋白水平变化；流式细胞仪(FCM)分析细胞周期；RT-PCR和细胞免疫荧光测定重组腺病毒Ad-RB94感染A549细胞前后RB94基因对A549细胞中SphKs基因含量的影响。结果：流式细胞仪测定结果显示：与空白对照组和空载体组相比,感染腺病毒Ad-RB94组,G2/M期细胞数目增加,而G0/G1和S期细胞数目减少,Real timePCR和细胞免疫荧光均显示：RB94基因能够抑制SphKl表达、增强SphK2表达。结论：RB94基因可使阻滞于G2/M期细胞数目增加。同时,RB94基因可抑制A549细胞中SphKl的表达、增强SphK2的表达。第三部分RB94基因的对肺腺癌裸鼠皮下移植瘤作用的实验研究目的；研究RB94基因对肺腺癌A549细胞裸鼠皮下种植瘤的生长的抑制作用及SphKs表达的影响。方法：采用皮下接种人肺腺癌A549细胞悬液的方法构建裸鼠种植瘤模型,Real time PCR检测RB94基因在裸鼠瘤组织的表达,观察RB94基因对肺腺癌裸鼠皮下移植瘤的生长抑制作用。Hoechst染色检测细胞凋亡,Real time RT-PCR和组织免疫荧光检测重组腺病毒Ad-RB94注射后RB94基因对裸鼠肿瘤中SphKs基因表达含量的影响。结果：与空白对照组、空载体组相比,注射腺病毒Ad-RB94组的裸鼠皮下移植瘤的生长速度明显减慢,肿瘤的体积明显减低(P<0.05),抑瘤率达60.5%。注射腺病毒Ad-RB94组的细胞凋亡率为26%,Real time PCR和组织免疫荧光均显示：RB94基因能够抑制SphK1表达、增强SphK2表达。结论：RB94基因对肺腺癌A549裸鼠皮下种植瘤的生长有明显的抑制作用且诱发肿瘤细胞凋亡,RB94基因可抑制SphK1的表达、增强SphK2的表达。