糖尿病相关物质的微流控检测芯片研究

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分析仪器的微型化和集成化是分析测试发展的重要趋势,微流控分析系统正是在这样的趋势下应运而生的一个交叉性的研究领域。目前微流控芯片集成化研究的一个难点在于如何实现外部设备的“对接”。“对接”意味着有适宜的小型化设备与之匹配。这一难题的解决才能实现真正意义上的“微”而“全”。以检测器的集成化为例,首推电化学检测。它具有其他检测方法所不具备的一些独特优势:技术要求相对简易,便于集成,灵敏度不会因为通道尺度的微型化而降低等。同时,在现代临床分析实验室中,糖尿病参数的检测一般需要借助大型仪器,价格昂贵、操作复杂、对数据分析要求高,因此难以在普通实验室中实现糖尿病各类参数的检测。   本文在充分发掘PDMS材料自身特性的基础上寻求与其他技术的结合点,建立针对微流控芯片集成化、功能化的新技术,发展糖尿病参数芯片检测方法,为糖尿病的临床分析研究提供强有力的平台。本论文的研究成果如下:   1、提出了一种简易新颖的金属纳米带电极的制备方法,并用于微流控芯片的电化学检测。我们借助掩膜对PDMS表面区域选择性地进行氧等离子体处理,通过化学镀的方法在处理过的PDMS表面选择性地镀上金膜和铜膜。通过这种方法,可以制得表面均匀并且厚度平均为100 nm左右的金膜和铜膜。在镀有金膜和铜膜的PDMS基片上覆盖一层PDMS盖片,形成三明治结构。将其剖面切开,即可制得纳米金带电极和铜带电极。我们将制得的电极与芯片集成用于芯片电泳电化学检测。实验结果表明,该种电极可成功的用于检测氨基酸、蛋白质和神经递质类分子。此外,我们将纳米金、铜带电极与双通道芯片集成,该集成体系可以成功地辨别电活性与非电活性的氨基酸。   2、提出了一种新颖的用于糖尿病多参数同时测定的方法。这种方法是基于前一章在PDMS表面化学镀金膜和铜膜的基础上发展而来的。我们将镀有金属膜的PDMS通过层层叠加的方式,构建成三明治结构,然后切开其剖面,制备成三维纳米带阵列电极体系。我们将该阵列电极体系与多通道微流控芯片集成,用于糖尿病多参数的同时测定。参数包括:葡萄糖,糖尿病代谢产物醛类化合物(乙二醛、甲基乙二醛)和小分子有机酸(乳酸、尿酸和2-羟基丁酸)。在优化的分离检测条件下,葡萄糖、醛类化合物和小分子有机酸的电化学响应信号分别在10-2000μM、1-500μM和5-600μM浓度范围内呈现良好的线性关系,检测限分别为4μM、0.5μM和3μM(S/N=3)。我们将该体系用于人体血样中葡萄糖、醛类化合物和小分子有机酸的测定,取得了良好的效果。该集成系统为代谢组学中多参数代谢产物的同时分离检测提供了一个简易、廉价、有效的分析平台。   3、研制成一种基于酶反应器的微流控芯片集成金纳米带电极系统,并将其用于糖尿病参数甘油三酯(TG)的分析检测。我们利用共价键合的方法,将三种酶:脂肪酶、甘油激酶(GK)和甘油三磷酸氧化酶(GPOx)固定在具有壳/核结构的壳聚糖/Fe3O4复合纳米微球上。该固定酶的方法简单,成本低廉。利用外加磁场的作用,将固定有酶的磁性微球填充在微流控芯片分离通道内,从而得到微酶反应器。在电渗流驱动下,蛋白质溶液流过微流控芯片通道,从而得到快速的酶解。该方法易于操作、成本低,并且很好地解决了以前文献报道中芯片酶反应器无法更新使用的缺点。当撤去外加磁场时,磁性微球可以方便地从微通道内导出,再通过引入新的固定酶的磁性微球,就可以使微流控芯片酶反应器再生。在TG的分析检测中,我们优化了相关参数,包括检测电位、缓冲溶液pH、三磷酸腺苷的浓度(ATP,mM)、分离电压和温度。我们采用安培检测法对集成了不同长度的酶反应器(1.0 cm、2.0 cm和3.0 cm)进行了研究。结果发现,随着酶反应器长度的增加,检测的线性范围由0.02-4.0 mM增加到0.01-10.0 mM,检测限则由15μM降低至6.0μM。酶反应器保存40天后仍然保持了70%的初始活性。我们将该系统应用于人血样中TG浓度的检测,取得了良好的效果。   4、利用微波溶剂热法制备Fe3O4磁性纳米微球,并利用简易的化学氧化合成法和自组装的方法制备了具有三重壳/壳/核结构的Au/chitosan/Fe3O4复合纳米微球。该复合纳米微球磁性可控,同时壳聚糖的存在为金纳米粒子的固定提供了一优良的亲和基质。我们利用金纳米粒子来固定抗糖化血红蛋白抗体,并将固定有抗体的磁性微球通过外加磁场填充在微流控芯片分离通道内,并集成金纳米带电极,从而制得微流控免疫传感芯片。在糖化血红蛋白的分析检测中,我们优化了相关参数,包括检测电位、驱动电压、抗体浓度、一抗二抗的浓度、孵化时间、孵化温度等。在优化的电泳条件及检测电位下,检测的线性范围为0.05-1.5μgmL-1,检测限为0.025μmL-1。我们将该系统应用于人血样中HbAlc浓度的检测,取得了良好的效果。
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