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目的:通过建立老年大鼠体外循环(cardiopulmonary bypass,CPB)导致的术后认知功能障碍(postoperative cognitive dysfunctions,POCD)模型,初步探讨老年大鼠CPB后POCD及海马神经元凋亡与神经调节素受体降解蛋白(Nrdp1)的相关性。通过慢病毒构建空载质粒、Nrdp1过表达及沉默海马神经元细胞,探讨Nrdp1在缺氧复氧模型中对神经元细胞凋亡的调控作用;并通过基因干扰大鼠海马Nrdp1的表达,在载体水平探讨Nrdp1对老年大鼠CPB后POCD的影响及其发挥作用的调控机制是否与Nrdp1泛素化降解底物蛋白Erb B3及下游AKT信号通路,促进神经元凋亡有关。方法:第一部分选取18月龄SD(Sprague-Dawley,SD)雄性大鼠60只,按照随机数字表法分为三组(n=20),即对照组(C组)、假手术组(S组)、模型组(M组)。建模前对老年大鼠进行为期5天的行为学基线测试及Morris水迷宫训练。C组做为空白对照组,S组大鼠只做对应的血管结扎,而未进行CPB,M组为CPB组。通过Morris水迷宫实验观察三组老年大鼠术后第1、3、7天行为学的改变,包括1.定位巡航实验(测量逃逸潜伏期和游泳速度)、2.空间探索实验(测量停留时间百分比和停留路程百分比),以评价CPB对学习、记忆功能的影响。造模结束后,通过使用酶联免疫吸附法(Enzyme Iinked immunosorbent assay,ELISA)检测C、S、M三组大鼠在CPB后第1、3、7天海马组织中炎因子TNF-α、IL-1β的含量。用Western-blot实验方法检测C、S、M三组大鼠CPB后海马组织中Nrdp1、Erb B3、p-AKT、C.Caspase3的表达水平。通过TUNEL染色法(Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling,TUNEL),分别观察C、S、M三组大鼠海马CA1、CA3、DG区的神经元凋亡情况,并计算其凋亡指数。第二部分体外培养海马原代神经元细胞,采用重组克隆技术,在细胞培养的第5天将慢病毒转染到培养所得的海马原代神经元,构建特异性Nrdp1过表达组、特异性Nrdp1沉默组以及空载质粒组海马神经元。慢病毒转染72小时后构建细胞缺氧复氧模型,将海马原代神经元按照随机数字表法分为5组:空白对照组(C组)、缺氧复氧组(H/R组)、空载质粒缺氧复氧组(H/R+NC组)、Nrdp1过表达缺氧复氧组(H/R+Nrdp1组)、Nrdp1沉默缺氧复氧组(H/R+shNrdp1组)。Western blot检测Nrdp1、ErbB3、p-AKT、AKT和C.Caspase3蛋白的变化情况。采用MTT法检测神经元的活性。流式细胞仪检测神经元的凋亡情况。第三部分选取18月龄SD雄性大鼠60只。15只大鼠进行预实验,通过颅脑定位仪将慢病注射大鼠海马CA1区,构建空载质粒、Nrdp1过表达及沉默大鼠。剩余45只大鼠实施CPB手术,随机分为5组(n=9):空白对照组(C组)、体外循环组(M组)、空载质粒体外循环组(M+NC组)、Nrdp1过表达体外循环组(M+Nrdp1组)、Nrdp1沉默体外循环组(M+sh Nrdp1组)。通过Morris水迷宫实验观察五组老年大鼠术后行为学的改变,包括1.定位巡航实验、2.空间探索实验,以评价CPB对学习、记忆功能的影响。TUNEL荧光染色,观察各组大鼠海马CA1区的海马神经元凋亡情况。Western blot实验方法检测五组大鼠在CPB后海马组织中Nrdp1、ErbB3、p-AKT、AKT和C.Caspase3蛋白的变化情况。结果:第一部分(1)术前行为学基线测试及Morris水迷宫训练中三组大鼠的行为学指标差异无统计学意义,相比于前一天各组大鼠在训练后的逃逸潜伏期缩短,停留路程百分比、停留时间百分比均增加。(2)造模结束后,在第1、3、7天的Morris水迷宫认知功能的测试中,相比于C组,S组大鼠游泳速度、逃避潜伏期、隐匿平台象限停留路程百分比和隐匿平台象限停留时间百分比差异无统计学意义(P>0.05);相比于C组及S组,M大鼠组逃避潜伏期增加、隐匿平台象限停留路程百分比和隐匿平台象限停留时间百分比明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)相比于C组,S组在术后第1、3、7天海马中的TNF-α浓度差异无统计学意义(P>0.05);相比于C组及S组,M组术后第1、3、7天海马中TNF-α浓度明显增高,差异有统计学意义(P<0.05)。相比于C组,S组在术后第1、3、7天海马中的IL-1β浓度差异无统计学意义(P>0.05);相比于C组及S组,M组在术后第1、3、7天海马中的IL-1β的浓度明显增高,差异有统计学意义(P<0.05),最高值在术后第3天出现。(4)TUNEL染色观察三组大鼠术后CA1区、CA3区、DG区神经元凋亡情况。相比于C组,S组大鼠海马CA1、DG区神经元的凋亡指数差异无统计学意义(P>0.05);相比于C组及S组,M组大鼠海马CA1、DG区神经元凋亡指数增加,差异有统计学意义(P<0.05);三组大鼠CA3区神经元凋亡情况差异无统计学意义(P>0.05)。(5)Western blot检测方法结果显示:相比于C组,S组大鼠术后Nrdp1、ErbB3、C.Caspase3和p-AKT表达差异无统计学差异(P>0.05);相比于C和S组,M组大鼠CPB术后Nrdp1、C.Caspase3表达增加,差异有统计学意义(P<0.05);相比于C和S组,M组大鼠CPB术后p-AKT、ErbB3的表达减少,差异有统计学意义(P<0.05)。第二部分(1)对培养5天的海马原代神经元用神经元特异性烯醇化酶(Neuronspecific enolases,NSE)染色鉴定其纯度在90%以上。病毒转染后的三组海马神经元中根据绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Proteins,GFP)的表达情况,可看出MOI=5时转染效率在80%以上。实时定量PCR(Polymerase Chain Reaction,PCR)及Western blot检测结果显示,空质粒、Nrdp1过表达、Nrdp1沉默组三组细胞中Nrdp1表达差异具有统计学意义(P<0.05)。(2)经过缺氧复氧干预后,五组神经元Western blot检测结果为:Nrdp1过表达缺氧复氧组(H/R+Nrdp1组)相比于空白对照组(C组)、缺氧复氧组(H/R组)、空载质粒缺氧复氧组(H/R+NC组)、Nrdp1沉默缺氧复氧组(H/R+shNrdp1组),海马神经元中Nrdp1、C.Caspase3表达增加;Erb B3、p-AKT表达减少,差异有统计学意义(P<0.05)。Nrdp1沉默缺氧复氧组(H/R+shNrdp1组)相比于缺氧复氧组(H/R组)、空质粒缺氧复氧组(H/R+NC组)、Nrdp1过表达缺氧复氧组(H/R+Nrdp1组),海马神经元中Nrdp1、C.Caspase3表达减少;Erb B3、p-AKT表达增加,差异有统计学意义(P<0.05)。各组神经元细胞间AKT表达差异无统计学意义(P>0.05)。(3)MTT法检测和流式细胞仪检测结果显示:Nrdp1过表达缺氧复氧组(H/R+Nrdp1组)相比于空白对照组(C组)、缺氧复氧组(H/R组)、空载质粒缺氧复氧组(H/R+NC组)、Nrdp1沉默缺氧复氧组(H/R+sh Nrdp1组),海马神经元活性降低、凋亡增加(P<0.05);Nrdp1沉默缺氧复氧组(H/R+shNrdp1组)相比于缺氧复氧组(H/R组)、空载质粒缺氧复氧组(H/R+NC组)、Nrdp1过表达缺氧复氧组(H/R+Nrdp1组),海马神经元细胞活性高、凋亡减弱(P<0.05);缺氧复氧组(H/R组)、空载质粒缺氧复氧组(H/R+NC组)两组细胞间的活性和凋亡差异无统计学意义(P>0.05)。第三部分(1)术前行为学基线测试及Morris水迷宫训练中大鼠的行为学指标差异无统计学意义,术前大鼠均无学习记忆功能损伤。(2)通过海马CA1区注射慢病毒,构建空载质粒对照、Nrdp1过表达、Nrdp1沉默三组大鼠,实时定量PCR及western blot检测结果显示:空载质粒、Nrdp1过表达、Nrdp1沉默组三组大鼠海马中Nrdp1表达量差异具有统计学意义(P<0.05)。(3)体外循环后五组大鼠Morris水迷宫认知功能的测试结果显示:Nrdp1过表达体外循环组(M+Nrdp1组)相比空白对照组(C组)、体外循环组(M组)、空载质粒体外循环组(M+NC组)、Nrdp1沉默体外循环组(M+shNrdp1组),大鼠逃避潜伏期延长,隐匿平台象限停留路程百分比和隐匿平台象限停留时间百分比下降,差异具有统计学差异(P<0.05);Nrdp1沉默体外循环组(M+shNrdp1组)相比于体外循环组(M组)、空载质粒体外循环组(M+NC组)、Nrdp1过表达体外循环组(M+Nrdp1组),大鼠逃避潜伏期缩短,隐匿平台象限停留路程百分比和隐匿平台象限停留时间百分比增加,差异具有统计学差异(P<0.05)。体外循环组(M组)相比于空载质粒体外循环组(M+NC组)术后行为学测试差异无统计学意义(P>0.05)。(4)TUNEL染色观察五组大鼠术后CA1区神经元凋亡情况。M+Nrdp1组大鼠相比于C组、M组、M+NC组、M+shNrdp1组,大鼠海马CA1区神经元凋亡增加,差异有统计学意义(P<0.05);M+shNrdp1组大鼠相比于M组、M+NC组、M+Nrdp1组,大鼠海马CA1区神经元凋亡减少,差异有统计学意义(P<0.05)。(5)Western blot检测方法结果显示:M+Nrdp1组相比于C组、M组、M+NC组、M+shNrdp1组大鼠海马Nrdp1、C.Caspase3表达增加,ErbB3、p-AKT表达减少,差异有统计学意义(P<0.05);M+sh Nrdp1组相比于M组、M+NC组、M+Nrdp1组大鼠海马Nrdp1、C.Caspase3表达减少,Erb B3、p-AKT表达增加,差异有统计学意义(P<0.05)。各组神经元细胞间AKT表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论:(1)老年大鼠CPB后认知功能受损,CA1、DG区神经元凋亡明显,POCD的发生发展与海马神经元的凋亡有密切的联系。(2)CPB后老年大鼠海马Nrdp1、C.Caspase3的表达量明显增高,老年大鼠CPB后POCD的发生及神经元凋亡伴随着Nrdp1表达量的增高。(3)通过慢病毒干扰海马神经元Nrdp1的表达,能够在细胞水平影响神经元的凋亡,其机制是Nrdp促进ErbB3的泛素化降解,降低ErbB3及下游信号通路p-AKT,从而促进凋亡现象的发生。(4)基因工程调控Nrdp1能够有效预防和改善老年大鼠CPB后的POCD的发生及海马神经元的凋亡,其相关机制与Nrdp1/ErbB3/p-AKT/C.Caspase3信号通路有关。