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干细胞移植是近年来医学领域乃至整个生命科学领域的研究热点和前沿,其具有高度的自我更新能力和多向分化潜能,并能在体内外表达多种外源目的基因,因而作为种子细胞被广泛用于细胞疗法和基因疗法的研究中。随着功能基因组学和蛋白质组学的进一步发展,干细胞的基础以及临床应用研究也取得了突破性进展。骨髓来源的间充质干细胞是起步较早研究较深入的成体干细胞,长期以来人们一致认为它是骨髓中一类高度黏附的成纤维细胞样细胞,然而Miao等最近的实验结果显示:大鼠骨髓中存在一种非黏附状态的间充质干细胞,体外培养条件下能够贴壁生长形成克隆,给予以往用于骨髓间充质干细胞的诱导条件也可以分化为三种间质终末期细胞,注射到亚致死剂量射线照射的小鼠体内可以参与其造血重建,表现出一定的多分化潜能。本文将在此理论基础上通过反复转移的非黏附细胞培养法分离小鼠骨髓中的非黏附间充质干细胞;观察表皮生长因子对非黏附间充质干细胞克隆形成效率的调节作用;并深入探讨非黏附骨髓间充质干细胞在体外、体内尤其是缺血损伤的微环境中分化为神经细胞的潜能,为这些细胞进一步用于细胞移植治疗相关疾病提供技术参数。第一部分小鼠非黏附骨髓间充质干细胞的分离培养、鉴定以及表皮生长因子对其克隆形成效率的影响目的分离培养并鉴定小鼠骨髓中的非黏附间充质干细胞(Non-adherent Bone-Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells,NA-BM-MSC);观察表皮生长因子(Epidermal Growth Factor,EGF)对NA-BM-MSC产生成纤维细胞集落形成单位(colony-formingunits-fibroblast,CFU-F)效率的影响。方法分离小鼠总骨髓细胞,分两组体外培养,一组在总骨髓细胞中加入10ng/mL的EGF,另一组为对照组,每天转移未贴壁的非黏附骨髓细胞(Non-adherent Bone MarrowCells,NA-BMC)到新的培养皿中继续培养,每组中各皿细胞长满12天后,亚甲基蓝染色显示形成的克隆,计数克隆个数;在总骨髓细胞培养到第四天时收集未贴壁的NA-BMC到新的培养皿中,待细胞贴壁生长达融合后传代纯化,取第四代细胞接种于向脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞诱导分化的培养液中,2周后分别进行油红染色、抗Ⅱ型胶原的免疫组织化学染色以及茜素红染色检测脂肪滴、Ⅱ型胶原和钙化结节的形成和表达情况;流式细胞检测表面标记物的表达。结果反复转移未贴壁NA-BMC到新培养皿继续培养的过程中,不仅总骨髓细胞可以贴壁形成CFU-F,而且反复转移的未贴壁NA-BMC也能不断贴壁并形成CFU-F;总骨髓细胞培养到第四天时收集的NA-BMC经脂肪细胞诱导液诱导后,油红染色可见细胞内产生大量油滴;经软骨细胞诱导液诱导后有软骨细胞特异性Ⅱ型胶原表达;经成骨细胞诱导液诱导后能够形成钙化结节;这些细胞高表达CD105、CD13,而不表达CD34、CD45等造血干细胞的特异性标记。加EGF刺激组每次转移的非黏附细胞贴壁生长后得到的细胞数和克隆数均比对照组多(P＜0.05),是对照组的3倍。结论小鼠骨髓细胞培养过程中,24小时内未贴壁的NA-BMC转移到新培养皿中继续培养能够重新贴壁并形成CFU-F,并且NA-BMC所形成的克隆具有向脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞分化的能力,具备了干细胞自我复制更新和多分化潜能的两大特性,并表达间充质细胞的特异性标记物,因此称其为非黏附骨髓间充质干细胞(NA-BM-MSC)。EGF能有效促进NA-BM-MSC的增殖,进一步提高了该细胞的富集效率。多分化潜能;表皮生长因子;增殖第二部分非黏附骨髓间充质干细胞体外向神经细胞分化的实验研究目的探讨骨髓中存在的NA-BM-MSC在体外向神经细胞分化的能力。方法分离小鼠骨髓总细胞进行培养,于第四天收集未贴壁的NA-BMC到新的培养环境中继续培养,待细胞贴壁融合后传代纯化,取第四代细胞用于诱导实验;细胞按照1X10~3/cm~2的密度接种于预置盖玻片的六孔板中,细胞贴壁后,更换培养液为含20ng/ml的EGF和20ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子-2(b-FGF)的诱导液进行诱导,2周后,甲苯胺蓝染色和抗神经细胞特异性核蛋白、抗神经中间丝蛋白的免疫细胞化学染色检测神经细胞特异性蛋白的表达。结果总骨髓细胞和NA-BM-MSC经过EGF和b-FGF的诱导后都能表达神经特异性蛋白:NeuN/NF-200/尼氏体。结论NA-BM-MSC在适当的条件下能够被诱导分化成神经细胞,为下一步用于体内实验的研究提供了保证。第三部分非黏附骨髓间充质干细胞在缺血损伤脑内向神经细胞分化的实验研究目的探讨骨髓非黏附间充质干细胞(non-adherent bonemorrow mesenchymal stem cells,NA-BM-MSC)在缺血损伤的脑内存活以及向神经细胞分化的能力。方法从β-Gal转基因小鼠分离总骨髓细胞,培养到第四天时,收集未贴壁的NA-BMC到新的培养环境中继续培养,贴壁增殖,待生长到融合时传代纯化,取第4代NA-BM-MSC定向移植到小鼠大脑中动脉阻塞脑缺血模型脑内,8周后LacZ组织化学染色和免疫组织化学染色法观察供体细胞在缺血脑内微环境中的存活情况以及神经元特异性核蛋白(NeuN)、神经胶质细胞特异性酸性蛋白(GFAP)的表达。结果LacZ组织化学染色发现在缺血侧供体细胞能够存活,免疫组织化学单染和双染后发现在缺血模型的坏死区及坏死边缘区都检测到β-Gal阳性的供体细胞,部分细胞还同时表达神经元和神经胶质细胞特异性蛋白NeuN和GFAP。结论小鼠骨髓内的NA-BM-MSC在缺血损伤的脑内能够存活、迁移,部分细胞还能分化为成熟的神经元或神经胶质细胞参与脑损伤的修复,为下一步作为种子细胞用于移植修复实验提供了保证。