谷氨酰胺转胺酶(TGase)能够催化蛋白质分子内和分子间酰胺基转移反应,使蛋白质发生交联,改变蛋白质的性质,从而在食品、医药、纺织等行业有极大的应用空间。目前商业化的谷氨酰胺转胺酶主要由茂原链霉菌发酵生产,由于茂原链霉菌的单位产量较低,工业生产中成本较高,为了降低谷氨酰胺转胺酶产量降低生产成本,本文通过原生质体融合的方法选育谷氨酰胺转胺酶(MTGase)高产菌株。本文主要研究内容以茂原链霉菌为出发菌株,建立并优化原生质体制备方法,探究不同菌株间原生质体制备及再生的差异,优化原生质体融合条件,通过多轮的原生质体融合筛选高产菌,对高产菌株进行碳源氮源初步优化,并进行发酵罐小试。主要结论如下：1)原生质体制备最适条件为：以108个孢子的接种量接种到YEME培养基中30℃ 200 r/min培养36-45h,溶菌酶浓度为8 mg/mL,温度为30℃,时间为90-180 min。酶解后的菌悬液以500 r/min 15 min提取分离得到的原生质体的纯度和浓度最高。原生质体保存在P buffer或含有20%甘油的Pbuffer中,在4℃或-20℃条件下8天内原生质体数量变化不大。原生质体再生后的菌落直径较小,与菌丝生成的菌落直径差异显著,96孔板发酵后两种不同直径大小的菌落酶活有显著性差异。不同的茂原链霉菌的原生质体在显微镜下观察,大小和均匀程度有显著性的差异。2)为达到更好的融合效果,探索不同菌株的原生质体制备及再生差异,酶解温度为30℃酶浓度为6 mg/mL时不同菌株最佳酶解时间不同,菌株266、5591、D为1h,菌株A、B为2 h。该条件下4株菌的原生质体纯度分别为99.9%、98.9%、99.9%、73.6%,再生比率分别为699.44%、351.96%、1885.39%、10.31%。4株菌的原生质体再生菌落的形态有差异。3)PEG分子量越小对原生质体再生数量的影响越小；原生质体经PEG处理后酶活没有显著性差异,但与菌丝发酵酶活相比,不同菌株差异不同。原生质体60℃180 s致死率达到100%,30 W紫外照射,照射距离为15 cm时120s原生质体致死率达到100%。4种分子量的PEG中,PEG2000的融合率最高为1.47‰,融合时间最适为30 min。显微镜观察原生质体融合过程,可以观察到大量原生质体不断聚集成团,形成直径较大的融合细胞体。实验采用两种不同的96孔板初筛方法,融合子直接进行96孔板初筛和融合子分纯扩增后进行96孔板初筛,第一种,准确率低,目的性强,工作量小,第二种方法,准确度高、工作量大。两种方法各有优势和劣势,高产菌株筛选中采用两种不同的方法。在菌株A和菌株847中,发酵液的颜色深浅与酶活高低成正相关,发酵液颜色越深酶活越高,该特性可以作为高产菌株选育的标准之一,提高筛选效率,降低工作量。4)原生质体融合的亲本菌株在30 ℃ 6 mg/mL的酶浓度条件下,达到最佳原生质体制备及再生状态的时间不同,poA为30 min,再生比率47.43%,原生质体纯度为91.08%；poB为90min,原生质体的浓度可达2.235×105个/mL,再生比率达到591.22%,是poA的12.47倍；poC为15 min,再生比率24.47%,原生质体纯度为97.74%；poD最适时间为45 min,再生比率为158.32%,纯度为96.44%。在多轮的融合中,通过96孔板初筛、试管复筛、摇瓶发酵选育优良菌株,对其中6株研究发酵产酶情况,菌株102302产酶趋势仅与出发菌株poD一致,酶活比poD提高了64.04%；菌株112528与4株出发菌株产酶趋势都不同,酶活比poA提高25.38%,比poC提高23.84%,比poD提高84.01%,比poE提高16.34%;5)对3株高产菌株初步优化碳源氮源,最适碳源为葡萄糖和甘油,最适氮源为鱼粉蛋白胨和蛋白胨。对菌株112528进行3L发酵罐小试,研究代谢特征,MTGase在16h开始迅速积累,在40 h酶活最高为9.28 U/mL；溶氧在发酵开始迅速下降,12h下降至3.3%；pH随发酵时间先下降后升高在24h最低为6.24,48 h后又下降；在24 h甘油消耗殆尽,生物量不断增加至0.033 g/mL;氨基氮先下降后升高,在24 h最低为0.68g/L。