1.研究背景铜绿假单胞菌(P.aeruginosa,PA)是医院获得性感染的重要的条件致病菌。碳青霉烯类抗菌药物因其超广谱的抗菌活性,曾一度作为革兰氏阴性菌的一线用药,但随其临床广泛甚至不合理应用,碳青霉烯耐药菌株不断出现,特别是碳青霉烯类耐药的铜绿假单胞菌(Carbapenem-resistant P.aeruginosa,CRPA)导致的感染不断被报导。CRPA感染会增加患者发病率和病死率,严重威胁人类健康,单独使用一种抗生素治疗很难保证临床抗感染的效果。抗菌药物的联合方案被越来越多的临床医生采用,体内外实验已得到证明,2种药物联合甚至3种药物联合可以达到较为理想的治疗效果。为帮助临床对泛耐药的革兰氏阴性杆菌(XDR-GNB)感染的诊断与治疗,选择合理的给药方式,我国22位临床医师、临床微生物学家与临床药理学家等多学科专家对XDR-GNB感染相关的问题达成抗菌治疗专家共识[9],应对XDRPA感染,该共识推荐两药联合与三药联合的方案。目前,许多非抗菌药物如某些作用于人类细胞的离子通道调节剂、环氧酶酶抑制剂、组蛋白脱乙酰酶抑制剂、传统中药中常用的清热解毒类药物,中药及中药单体筛选出的一些抗菌活性成分等有抗真菌的活性,能增加抗真菌药物的敏感性在本课题组内已得到证实。文献中报道,某些中药提取成分与抗菌药物联合应用对细菌耐药性有不同程度的逆转。2.研究目的本研究旨在验证CRPA菌株耐药是否与碳青霉烯酶及生物膜的相关性及中国专家共识推荐治疗XDRPA药物联合方案和非共识方案的有效性,以期寻找对抗CRPA的新思路。3.研究内容与方法3.1实验用菌株收集、敏感性测定与耐药背景分析选取前期从山东省某三甲医院获得的临床分离的6株多药耐药铜绿假单胞菌菌株,菌种的鉴定利用法国梅里埃公司的ATB细菌鉴定仪鉴定。根据CLSI M100-S25推荐的测定细菌敏感性的方法:微量肉汤稀释法。将13种临床常用抗PA的药物以适宜的溶剂制备成浓度为2560μg/m L的母液,以二倍稀释法分别将抗菌药物稀释,然后按照浓度由低到高的顺序依次加入到96孔板中的第2列至第11列,呈一系列梯度浓度。第1列作为生长对照组,第12列作为空白对照组。将加完菌液和药物的96孔板置于35℃恒温培养箱中过夜培养,以肉眼可见完全抑制细菌生长的药物浓度值为最低抑菌浓度值MIC。采用Carba NP试验测试细菌是否产生碳青霉烯酶:挑取活化并接种于CAMHB固体培养基上的实验菌株单菌落,裂解并离心后取上清液,加入到含酚红溶液(0.05%,PH 7.8±0.1),亚胺培南终浓度(0.6mg/m L),Zn SO4(0.1mmol/L)的反应体系,使共100μL溶液。空白对照组除不含亚胺培南其他与实验组完全一致。6株菌分别设置实验组和空白对照组。置于37℃恒温培养箱孵育2 h,期间每隔0.5 h观察体系的颜色并在白色背景下与阴性对照组进行对比,以判断碳青霉烯酶的产生与否。采用结晶紫染色法判定实验菌株的成膜能力。将实验菌株在4 m L的LB培养基中溶解,在35℃恒温条件下震荡培养24 h,调整菌液浓度至5×105 CFU/m L,每孔吸取200μL加入到96孔板,空白对照组只加无菌LB培养液,每株菌设置3个复孔,空白对照组也设置3个复孔,整个体系置于35℃恒温培养箱中培养,24 h后弃培养液,加结晶紫溶液,室温下染色15min后用PBS磷酸缓冲液冲洗3次,室温干燥后加入95%的乙醇,完成后测590 nm处吸光度值,取3个复孔的平均值。以空白对照孔的平均值+3倍空白对照的标准差作为cut off值(Ac)。实验组的A590 nm与Ac值比较,判断细菌成膜能力。3.2中国专家共识推荐的对抗XDRPA的药物组合对CRPA的效果评价采用微量肉汤稀释法对每药物组合中的药物分别进行倍比稀释,再分别将稀释好的药物按浓度从高到低的顺序加入到96孔板中,然后对应加入调整好浓度的菌液,使菌液终浓度为5×105 CFU/m L,无菌的CAMHB液体培养基作为阴性对照组。以FICI模型判断每一个药物组合是否有协同作用。首先,以PA11为代表菌株,对共识推荐所有组合方案进行初步的活性筛选,对初筛结果中呈现协同作用的9个药物组合,进一步测试其对6株CRPA的联合活性,同样以FICI模型判断药物组合的的协同抗菌作用效果。3.3非共识推荐药物组合对CRPA的体外联合作用本部分实验采用微量棋盘稀释法,分别对非共识推荐的部分抗菌药物联合方案以及抗菌药物与部分非抗PA药物的联合方案做活性评价,抗菌药物组合包括:亚胺培南+左氧氟沙星;亚胺培南+阿奇霉素;头孢他啶+左氧氟沙星;头孢他啶+阿奇霉素;磷霉素+利福平。非抗PA药物包括:铁离子干扰药物硝酸镓,氯化镓;细菌蛋白质合成抑制剂利奈唑胺;环氧酶抑制剂立克飞龙;4苯基丁酸;粘液溶解药物氨溴索;离子通道调节剂卡马西平;离子通道调节药物维拉帕米、氨氯地平、胺碘酮、氟桂利嗪;5-HT摄取抑制剂氟西汀,舍曲林;中药提取成分木犀草素,大黄酸,丁苯酞。协同效果用参照FICI模型评价。4.研究结果4.1实验用菌株收集、敏感性测定与耐药背景分析结果药敏试验结果表明,6株实验菌株对碳青霉烯类的亚胺培南、美罗培南以及比阿培南均有较强的耐药性,可以将6株铜绿假单胞菌确认为CRPA。在碳青霉烯类药物耐药的情况下,只有多粘菌素B和粘杆菌素仍有较好的抗菌活性,没有黏菌素类耐药菌的出现。Carba NP试验中,对照组的颜色呈现红色,碱性条件下酚红溶液的颜色,耐药菌株反应体系颜色呈现黄色,证明6株CRPA可产生碳青霉烯酶。结晶紫染色试验中,测得6株CRPA均有A590nm>Ac值,可证明所选菌株成膜阳性。综上结果,碳青霉烯类的亚胺培南、美罗培南和比阿培南在此实验中呈现出为高度耐药性,此次实验中对CRPA存在抗菌活性仅有粘菌素类两个药物粘杆菌素和多粘菌素B。碳青霉烯酶产生和生物膜的形成是铜绿假单胞菌对碳青霉烯类耐药的重要原因,Carba NP试验与结晶紫染色试验证明了试验所选的CRPA菌株碳青霉烯酶与生物膜产膜的均呈现阳性结果,由此可推断,碳青霉烯酶以及生物膜的形成两者是本实验中CRPA产生的部分原因。4.2中国专家共识推荐的对抗XDRPA的药物组合对CRPA的体外作用中国专家共识推荐的药物组合方案中对本实验所选的6株CRPA呈现的作用既包括协同和相加,也有部分组合呈现无关作用。呈现最好联合效果的是两种β-内酰胺类的药物组合方案,该类组合对本实验的6株CRPA展示不同程度的协同效果,其中头孢他啶+头孢哌酮舒巴坦两药的联合,在本次实验中现100%呈的协同率,头孢他啶+哌拉西林他唑巴坦协同率50%。其次是β-内酰胺类药物与其他药物的组合,氨曲南+磷霉素协同率66.7%。4.3非共识推荐药物组合对CRPA的体外联合作用该部分结果显示:非抗铜绿假单胞菌的一线用药磷霉素和利福平两种药物的联合对6株耐药菌呈现66.7%的协同作用。头孢他啶分别与左氧氟沙星、阿奇霉素的药物联合,协同率分别为50%,亚胺培南分别与左氧氟沙星、阿奇霉素的药物联合,协同率均为33.3%。部分非抗菌药物能不同程度的降低抗菌药物的最低抑菌浓度结果表明,大部分的非抗革兰阴性杆菌药物与亚胺培南联用并不会增加其抗菌活性,显示无关作用。硝酸镓和氯化镓单药MIC值范围多在4~8μg/m L,抗菌作用显著,但两种药物均不能增强抗菌药物的作用。5.研究结论碳青霉烯酶以及生物膜的形成是本实验中CRPA形成的部分原因。指南推荐方案的药物联合抗菌作用整体表现为部分协同作用,其中以两种β内酰胺类药物联合时协同作用较好,头孢他啶与头孢哌酮-舒巴坦联合抗菌活性最好。非抗铜绿假单胞菌的一线用药磷霉素和利福平两种药物的联合对6株耐药菌协同作用较好。本实验所选的大部分的非抗革兰阴性杆菌药物与亚胺培南联用并不会增加其抗菌活性,显示无关作用。硝酸镓和氯化镓单药抗菌作用显著,但两种药物均不能增强抗菌药物的作用。