研究背景及目的:裸鼹鼠长期生活于地底下的洞穴环境中,其周围环境氧气浓度极低,只有(10%~15%),其承受低氧环境的能力是生活于地上的哺乳类所不能比拟的。这表明,缺氧造成的损伤或病理改变在这种异常耐受低氧环境的啮齿类中较少或者被彻底清除。然而,对于这个物种耐受低氧环境的机制我们还不甚了解。在局部缺血性心脏病导致机体损伤的过程中,缺氧因素扮演着极其重要的角色。而且,在其他一些致死性损伤疾病的发展过程中往往继发缺氧。最新数据显示,局部缺血性心脏病在全球范围内特别是中等收入国家发病率呈逐年上升的态势,其是导致全球性疾病负担的主要原因。对裸鼹鼠独特的耐低氧机制进行研究,将有利于人类缺血性疾病的防治及为制定低氧环境医学保护措施提供新思路。另外,实体肿瘤的基本特征之一是局部的低氧微环境。目前已有的数据证实,局部的低氧微环境不仅是诱导肿瘤恶性转化的始动因素,而且其还可以诱导肿瘤细胞对放射化疗的抵抗。因此,实体肿瘤局部低氧微环境被认为与多种恶性肿瘤的治疗后复发、治疗效果差和不良预后密切相关。因此,阐明裸鼹鼠耐低氧的分子机制,将为恶性肿瘤的治疗提供新线索。研究方法:运用低氧舱控制氧气浓度,急性低氧环境(5%O2)处理成年(8月龄)裸鼹鼠1h、4h、8h、12h后,提取裸鼹鼠肌肉组织总RNA,运用转录组测序方法检测低氧处理后基因表达量变化,研究低氧环境对裸鼹鼠基因表达谱的影响。针对基因表达水平结果,筛选低氧处理前后差异表达的基因,并采用hierarchical聚类法对差异表达的基因进行聚类,对各组进行GO和KEGG pathway分析。研究差异表达基因GO功能分类及KEGG信号通路的富集情况。针对KEGG信号通路的富集情况,选取一个显著差异的信号通路(MAPK信号通路)里面的差异表达基因STMN1、JIP1/MAPK8IP1、JNK3/MAPK10,并根据GO功能分类,采用real-time PCR、Western Blotting验证差异基因的表达。进一步针对差异表达基因STMN1、JIP1/MAPK8IP1、JNK3/MAPK10,通过si RNA干扰技术沉默肌肉成纤维细胞中STMN1、JIP1/MAPK8IP1、JNK3/MAPK10的表达。运用流式细胞术检测细胞周期和凋亡情况,CCK8法检测细胞的增殖活性,研究STMN1、JIP1/MAPK8IP1、JNK3/MAPK10沉默对细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响。结果:差异表达基因的筛选与对照组相比,低氧处理1h、4h、8h、12h后裸鼹鼠肌肉组织中基因表达水平发生上调的总数分别为243个、304个、717个、527个,基因表达量发生下调的基因总数分别为344个、332个、487个、250个。在任意情况下与对照组相比较,表达水平发生上调的基因总数为1450个,发生下调的基因总数为971个。采用hierarchical聚类法把2337个差异表达的基因分成6个基因功能簇(cluster),显著地聚集到4个实验处理组中。Cluster1、Cluster2、Cluster3、Cluster4、Cluster5、Cluster6中含有的差异基因数目分别为566个、566个、227个、674个、108个、196个。cluster1中的基因在低氧1h组显著聚类,cluster2中的基因在低氧4h组显著聚类,cluster4、cluster5中的基因在低氧8h组显著聚类,而cluster3、cluster6中的基因在低氧12h组显著聚类。差异表达基因GO功能富集参照经典的基因功能分类体系﹣GO功能分类体系(Gene ontology),把各个cluster中的基因进行功能的聚集后发现,cluster1、cluster2、cluster3、cluster4、cluster5、cluster6中显著性富集的GO terms分别有1682个、1300个、1384个、2185个、637个、592个。其中cluster1、cluster2、cluster3、cluster4、cluster5、cluster6中差异最显著的GO terms分别为解剖结构形态(anatomical structure morphogenesis)、单一生物过程(single-organism process)、组织细胞成分(cellular component organization)、单一生物过程(single-organism process)、离子转运(ion transport)、细胞-细胞信号(cell-cell signaling)。差异表达基因KEGG信号通路富集参考KEGG数据库初步判断各个cluster中差异基因显著性富集信号通路的情况。cluster1、cluster2、cluster3、cluster4、cluster5、cluster6中差异表达基因最显著性富集的信号通路分别为焦点粘连(Focal adhesion)、扩张型心肌病(Dilated cardiomyopathy)、昼夜节律-哺乳动物(Circadian rhythm-mammal)、MAPK信号通路(MAPK signaling pathway)、甘氨酸,丝氨酸和苏氨酸代谢(Glycine,serine and threonine metabolism)、II型糖尿病(Type II diabetes mellitus)。差异表达基因的KEGG信号通路富集性分析结果表明,调控细胞粘连,细胞增殖、分化、凋亡以及氨基酸代谢的信号路径可能在裸鼹鼠的低氧应答反应中扮演着重要角色。体外实验验证差异表达基因(STMN1、JIP1/MAPK8IP1、JINK3/MAPK10)的表达低氧培养条件处理24h后,与对照组相比,裸鼹鼠肌肉成纤维细胞中STMN1、JIP1/MAPK8IP1、JNK3/MAPK10的表达水平均表现为显著上调。STMN1、JIP1/MAPK8IP1、JNK3/MAPK10表达的沉默显著地抑制了裸鼹鼠肌肉成纤维细胞的增殖活性,诱导细胞凋亡。并且,沉默STMN1的表达阻滞裸鼹鼠肌肉成纤维细胞在G0/G1及S期,沉默JIP1/MAPK8IP1、JNK3/MAPK10的表达阻断裸鼹鼠肌肉成纤维细胞于S期。结论:运用转录组测序的方法高通量筛选出裸鼹鼠肌肉组织在低氧处理后2337个差异表达的基因,并对这些差异表达的基因进行了GO功能分类和KEGG信号通路的富集。体外实验验证了其中三个差异表达基因(STMN1、JIP1/MAPK8IP1、JNK3/MAPK10)的表达,从而提示其可能在调控裸鼹鼠耐受低氧环境中发挥重要作用。