冰城链霉菌(Streptomyces bingchenggensis)是由本实验室发现的链霉菌家族中的新成员，次级代谢产物是米尔贝霉素(milbemycin)和冰城霉素(bingchengmycin)。前者是一类具有广谱抗虫活性的十六元大环内酯聚酮类化合物，对各种螨类都有高的防治效果；后者是一聚醚类抗生素，抗球虫活性强；二者在农业和畜牧业生产中已广泛应用。　　 nsdA基因(negative regulator of Streptomyces differentiation)是首先在天蓝色链霉菌(S. Coelicolor）中发现的一个全局性负调节基因，对天蓝色链霉菌的产孢形态分化与抗生素的合成有负调控作用。随后的研究发现在多种链霉菌中nsdA均保守存在。bldA是目前研究最透彻的形态分化调节基因之一，编码链霉菌基因组中唯一有效识别亮氨酸稀有密码子UUA的tRNA，通过控制稀有密码子UUA的翻译在多水平级联调控系统中发挥着重要作用。　　 基于链霉菌代谢调控网络的复杂性，nsdA和bldA基因普遍性和多效性，冰城链霉菌的新颖性，本实验的研究目的是验证nsdA和bldA基因存在于冰城链霉菌中的可能性，并探索它们对形态分化和次级代谢产物的合成的影响。　　 根据基因组已知的阿维链霉菌、天蓝色链霉菌nsdA和bldA基因及相邻的保守序列，设计引物，在冰城链霉菌226541总DNA中扩增得到nsdA和bldA基因（GeneBank登陆号 EU779992，FJ380950），通过生物信息学分析发现与其他链霉菌相比，冰城链霉菌nsdA基因序列同源一致性可达75％以上，而bldA基因的序列同源一致性高达86％。　　 利用λRed-mediated PCR-targeting方法构建nsdA和bldA基因置换载体，以含有39nt同源序列的引物进行PCR制备线性基因片段，电转化BW25113，利用其中的λRED重组系统，将目的基因用抗性卡壳置换，进而构建nsdA基因置换载体pBC929和bldA置换载体pBC529。然后通过属间结合转移进入冰城链霉菌中，通过抗性筛选，完成染色体上目的基因的置换，实验得到nsdA的基因置换菌株BC29和bldA基因置换菌株LC29。与野生株相比，nsdA基因置换菌株BC29表现出孢子颜色加深和色素产量增加的表型变化，HPLC分析发现突变株BC29发酵液中米尔贝霉素和冰城霉素的产量较野生株分别提高了250％和67％ ；bldA基因置换菌株LC29，产孢受抑制，表现为“光秃’表型，菌落颜色由黄白色变为鲜黄色，HPLC分析发现LC29的发酵液中不含米尔贝和冰城霉素组分。为了排除由于极性效应或其他位点突变造成的影响，进行了遗传互补实验，扩增含有完整目的基因的DNA片段酶切后联到整合载体pIJ8600的对应酶切位点，构建用于遗传互补的重组质粒pJC3和pJC5，经过属间结合转移进入相应基因中断菌株。在相同条件下培养，nsdA基因置换菌株BC29的遗传互补菌株 BC39和bldA基因置换菌株LC29的遗传互补菌株 LC39均恢复到野生株的状态，进一步证明突变株的变化是由于目的基因的中断引起的。以上研究表明nsdA基因参与了冰城链霉菌形态分化和次级代谢抗生素合成的调控途径，并起着负调控作用；bldA基因通过控制含有TTA密码子的基因的时空表达，调控着冰城链霉菌形态分化和次级代谢抗生素合成。