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目的:研究去甲斑蝥素(NCTD)对人肝癌HepG2细胞株增殖及凋亡的影响,进一步分析NCTD处理对RASSF1A基因甲基化状态的影响,初步探讨NCTD对RASSF1A基因可能的作用机制,为临床治疗提供理论依据。
方法:
1.选取肝癌HepG2细胞株作为研究对象,使用含不同浓度(5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml及80μg/ml)NCTD的培养基连续培养24h、48h及72h,倒置显微镜观察NCTD处理肝癌HepG2细胞株前后细胞形态学变化;并应用四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)法检测不同浓度组(5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml及80μg/ml)NCTD对肝癌HepG2细胞株增殖抑制作用,绘制生长抑制曲线。
2.透射电镜观察浓度为20μg/mlNCTD处理肝癌HepG2细胞株48h前后细胞超微结构的变化。
3.应用甲基化特异性PCR(methylation-specificPCR,MSP)法检测不同浓度组(10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml)NCTD处理肝癌HepG2细胞株72h后RASSF1A基因的甲基化状态变化。
4.应用蛋白免疫印迹(Westernblot)法检测不同浓度组(10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml)NCTD处理肝癌HepG2细胞株72h后RASSF1A基因蛋白表达的变化。
结果:
1.形态学变化:①倒置显微镜下观察发现癌细胞体积缩小,多角形趋于规则,核固缩,核质比例增大,染色质边集成块状,以上表现随浓度增加变化趋于显著;②透射电镜下观察发现细胞器肿胀,溶酶体增多,核质不均匀,线粒体空化。
2.MTT法检测发现NCTD明显抑制肝癌HepG2细胞株的增殖,而且随着药物浓度的增加,对肝癌增殖的抑制作用越明显,具有剂量依赖性(F=829.043,P<0.05)。同一浓度作用时间越长,抑制率越高(F=8.756,P<0.05),具有时间依赖性。
3.MSP显示空白组未经NCTD处理的肝癌HepG2细胞中RASSF1A基冈启动子区域呈甲基化状态,而实验组经NCTD处理72h后,RASSF1A基因启动子区域甲基化状态得到有效逆转。
4.Westernblot显示对照组未经NCTD处理的肝癌HepG2细胞中RASSF1A基因蛋白表达缺失,而实验组经NCTD处理72h后RASSF1A基因蛋白恢复表达,且实验组和对照组RASSF1A蛋白表达具有显著性差异(Z=10.324,P<0.05),实验组间两两比较亦具有显著性差异(P<0.05)。
结论:
1.去甲斑蝥素能够抑制肝癌HepG2细胞株的增殖,且其抑制作用随浓度的增加或时间的延长而增强,呈剂量和时间依赖性。
2.NCTD能够有效地逆转RASSF1A基因的甲基化状态,同时恢复该基因蛋白的重新表达。