草菇(Volvariella volvacea)作为一种重要的热带亚热带菇类,是世界上第三大栽培食用菌,具有很高的营养价值和经济价值。但是草菇在低温等非生物胁迫条件下无法正常生长结实,甚至会出现低温自溶现象,这对草菇产业的推广及后期保鲜造成很大的障碍。NADPH氧化酶(NADPH Oxidase),最初发现于动物的中性粒细胞和巨噬细胞中,是动植物以及部分微生物细胞产生氧化爆发的主要酶复合体,所产生的活性氧自由基在植物应答逆境胁迫过程中起到十分重要的作用,但在真菌应答非生物胁迫中的作用机制还未见报道。本研究以福建主栽品种“屏优一号”的两个单孢PYd15、PYd21以及杂交获得的异核体菌株H1521为对象,基于草菇的组学数据鉴定获得了草菇NADPH氧化酶复合体组成亚基的编码基因。通过对H1521菌丝的非生物胁迫诱导试验探讨草菇NADPH氧化酶及其编码亚基Cdc24对低温等非生物胁迫的应答机制,期望为草菇以及其他食用菌响应非生物胁迫机制的研究提供新方向。主要试验结果如下:(1)鉴定获得草菇NADPH氧化酶六个组成亚基,并经过转录组及基因组reads的重新定位分析得到六个亚基编码基因全长分别为:VvNoxA(2836bp);VvNoxB(3122bp);VvNoxR(3199bp);VvBemA(2515bp);VvRacl(1406bp);VvCdc24(4277bp)。(2)对NADPH氧化酶六个亚基的氨基酸序列进行生物信息学分析。具体结果如下:氨基酸同源比对发现六个亚基都具备相应的保守结构域;信号肽的预测结果表明,六个亚基没有信号肽;跨膜结构预测结果显示,除VvBemA没有跨膜结构外其余五个亚基都有至少具备一个跨膜螺旋,其中VvNoxA和VvNoxB都具备7个跨膜螺旋,符合细胞膜蛋白的特征。(3)为寻找合适的胁迫条件,对草菇H1521菌丝进行了 pH、温度、盐浓度、过氧化氢浓度的耐受性研究。结果表明:草菇H1521的最适生长pH为8;其中pH=4、pH=11、0.3mol/LNaC1、10mmol/LH2O2等极端条件为其耐受极限但不会致死,适合于后期胁迫应答机制的研究;4℃胁迫下孵育0-4个小时后菌丝并未自溶,将其放回35℃下继续培养,可恢复生长,但生长速度有所差异,孵育1h时与空白处理差异显著,可以作为后期胁迫的参考时间。(4)利用荧光定量PCR检测强酸、强碱、高盐、低温以及氧化胁迫诱导下草菇NADPH氧化酶各个亚基编码基因的表达水平,结果显示,各种非生物胁迫处理1h后均可使VvCdc24的表达量显著上调并达到空白对照的7-17倍,但是VvNoxA、VvNoxB、VvNoxR、VvRac1、VvBemA仅在部分胁迫刺激下上调表达。结果提示,VvCdc24除了作为NADPH氧化酶复合体组成亚基之外,可能还存在新的作用机制以响应非生物胁迫。(5)为了解Cdc24的表达规律,检测了该基因在不同菌丝生长时期以及不同时间低温胁迫下的差异表达情况,结果表明:不同的生长时期Cdc24的表达差异很大,呈现先下降后上升的趋势,推测菌丝在生长初期分裂比较旺盛,此时对Cdc24的需求量较大,而当菌丝长满平板后菌丝缺少生长空间分裂的速度减慢,此时Cdc24的表达水平最低,之后由于培养基质消耗殆尽、次生代谢产物的不断积累对菌丝产生越来越多的胁迫作用,此时细胞内的H2O2含量也不断上升,从而诱导Cdc24上调表达;草菇菌丝在受到0-60min的不同时间低温胁迫下,Cdc24的表达量呈现先上升后下降再上升的规律性变化,这与草菇谷胱甘肽S-转移酶(GST01)的表达模式十分相似,并且与菌丝细胞的H2O2含量变化比较一致,说明Cdc24同GST01可能在同一信号通路上并且都受到细胞内H2O2的调控。(6)通过外源添加NADPH氧化酶专一性抑制剂DPI、超氧化物歧化酶抑制剂DDC和活性氧清除剂Vc进一步探讨草菇NADPH氧化酶组成亚基VvCdc24响应非生物胁迫的具体机制,结果显示:50mmol/L的DPI可以有效抑制菌丝O2-的产生,并且可以有效抑制由低温、强酸、强碱、高盐引起的Cdc24基因表达的上调,但只能部分抑制H2O2对Cdc24的诱导作用,推测H2O2可以直接进入细胞并作为信号分子诱导Cdc24基因的上调表达;1mmol/L的DDC和2mmol/L的Vc均可有效降低菌丝细胞内H2O2的含量,但对低温引起Cdc24基因上调表达的抑制能力却不同,DDC仅能部分抑制该基因表达量的的上调,而Vc可以可以完全抑制由低温胁迫所引起的基因上调表达,这可能是由于Vc完全清除了细胞内的活性氧自由基而DDC仅抑制了 H2O2的产生但细胞内的O2-可以对Cdc24的表达起到诱导作用。以上结果表明,草菇在受到非生物胁迫时可以激活细胞内的NADPH氧化酶,并产生大量的O2-和H2O2等信号分子,这些信号分子可以诱导细胞内相关抗胁迫基因的上调表达,促使细胞对环境变化做出响应。在这个过程中,部分Cdc24可以作为NADPH氧化酶组成亚基引发活性氧自由基的形成,同时部分游离在细胞质中的Cdc24可以被活性氧所诱导并引起下游防御基因的上调表达。