颞下颌关节骨关节病(temporomandibular joint osteoarthritis, TMJ OA)是颞下颌关节紊乱病(temporomandibular joint disorder, TMD)中严重的疾病类型,其病因至今尚未明确。不过现已公认该病属于多因素共同作用导致的复杂疾病,例如年龄、性别、外伤、精神心理因素、免疫、咬合异常等。该疾病具有自限性的同时,也具有易感性。因此遗传因素,尤其基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)作为易感性标识被逐渐重视。在其它滑膜关节的退行性疾病中,单核苷酸多态性已得到广泛研究,而在颞下颌关节骨关节病中的研究却处于起步阶段。与颞下颌关节骨关节病易感性有关联的基因,目前鲜有报道,仅可查MMP-1基因启动子-16071G/2G多态性与巴西人群的颞下颌关节骨关节病相关。因此,我们从骨关节病最重要的软骨及软骨下骨两方面入手,探讨构成这两种组织的Ⅰ型胶原相关基因(与其分解代谢相关的MMP-1基因及与其合成代谢相关的COL1A1基因)单核苷酸多态性位点与该疾病易感性的关系。首先,我们比较了血液样本苯酚-氯仿法、磁珠法(用于住院患者)及拭子样本离心柱法(用于门诊患者)获取全基因组DNA的抽提方法的优劣,经比较后,我们决定以拭子法为主,处理门诊样本；以苯酚-氯仿法提取法为辅,处理住院患者血液样本。接着,通过高分辨率溶解曲线法对合格的DNA样本进行MMP-1,COL1A1基因分型,经过关联分析,探讨这些基因与软骨或软骨下骨退化的关联性。本研究分四部分,分别是：三种全基因组DNA提取方法的比较(研究一)；MMP-1基因多态性与颞下颌关节骨关节病的关系(研究二)；COL1A1基因多态性与颞下颌关节骨关节病的关系(研究三)；骨赘与非骨赘TMJ OA患者MMP-1, COL1A1基因多态性及临床观察(研究四)。以下是各研究的摘要：研究一研究背景与目的：近年来,遗传因素在颞下颌关节紊乱病易感性方面的作用被逐渐重视,因此如何高效地获得高质量的全基因组DNA是展开该类研究的基础。研究方法：我们结合临床上具体的情况,对于住院病人,我们利用检验科采集的空腹静脉血,采用比较成熟的苯酚-氯仿法(法一)及磁珠分离法(法二)抽提全基因组DNA；对于门诊病人,我们则采取无菌拭子刮取患者颊黏膜脱落细胞,通过离心柱分离的方法(法三),获取全基因组DNA。每种方法提取的DNA样本均被检测其浓度、纯度、完整性及后续实验效果。研究结果：337例血液样本采用方法一抽提(38例DNA样本纯度或浓度不合格,占总样本例数的11.3%),273例血液样本采用方法二抽提(22例DNA样本纯度或浓度不合格,占8.1%),397例颊黏膜拭子样本采用方法三抽提(21例DNA样本纯度或浓度不合格,占5.3%)。经t检验比较,三种方法提取的全基因组DNA纯度无明显差异(P>0.05)。测试比较每种方法的样本浓度,苯酚-氯仿法与磁珠法间存在明显差异(P=0.0002)；苯酚-氯仿法与拭子法之间无明显差异(P>0.05)；磁珠法与拭子法间无明显差异(P>0.05)。随机挑选三种方法抽提得到的合格纯度与浓度的DNA样本各20例,经琼脂糖电泳检测,发现均无明显降解,分子量较接近；再上样检测目标基因(MMP1) rs1799750位点基因型,均成功测得各自对应的基因型。结论：因此,可以得出以上三种方法抽提的全基因组DNA样本均适合后续基因组学实验的结论,但是方法三在其采样及后续的样本处理上更加便捷高效,适合大样本量的研究。研究二研究目的：本研究旨在研究MMP-1基因启动子上-1607号碱基的单核苷酸多态性(rsl799750)与颞下颌关节盘前移位及骨关节病的关系。研究方法：该实验一共纳入了185位健康个体(对照组,组A),141位单侧关节盘可复性前移位的患者(可复组,组B),以及321位单侧关节盘不可复性前移位的患者(不可复组,组C)。其中不可复组里有115位无骨关节病(单纯不可复组,组C-1),和206位有骨关节病(不可复伴骨关节病组,组C-2)。这些个体的单核苷酸多态性通过高分辨率溶解曲线法(high resolution melting assay, HRM)测得。在校准可能的协变量的前提下,采用多变量逻辑回归模型,两两配对比较这几组的基因型及等位基因的分布频率。实验结果：2G2G基因型频率在三组比较中都存在显著差异(PC-A<0.0005；PCl-B= 0.049；PC2-B=0.018).携带2G2G基因型的个体患有不可复性关节盘前移位、骨关节病的机率比起其他基因型携带者高(ORC-A=2.455；ORCl-B=1.849；ORC2-B=1.912)。1G2G基因型频率在两组对比中存在显著性差异(PC-A<0.0005；PC2-B= 0.041).1G2G基因型携带者患有不可复性关节盘前移位、骨关节病的机率比较高(ORC-A=2.641；ORC2-B=1.896)。结论：位于MMP-1基因启动子-1607号上的1G/2G单核苷酸多态性可能与不可复性关节盘前移位、骨关节病的易感性有关联。研究三研究背景与目的：COL1A1基因调控区域的G/T多态性明显影响骨质改建,可导致退行性改变。颞下颌关节退行性变的早期病理变化,主要表现在以骨密度降低为特点的骨质代谢的增强及进一步的骨质流失。因此,我们假设该基因位点可能也会导致颞下颌关节发生这种骨关节病样的骨质改变。研究方法：一共有130名骨质低密度样改变(骨皮质侵蚀、髁突吸收、囊腔样改变)的骨关节病患者,186名健康人被纳入研究。通过颊黏膜拭子法获取研究个体的全基因组DNA,该基因位点通过高分辨率溶解曲线法进行分型。通过多变量逻辑回归模型统计各种基因型间分布频率的差异。研究结果：研究未发现TT和TG基因型分布频率有明显的差异(P>0.05)。GG基因型分布频率有临界意义(P=0.043)；该基因型可能增加了低密度骨质改变的危险性(OR=1.643,95%CI:1.016.2.658)。结论：本研究表明GG基因型可能是颞下领关节发生低密度破坏的危险因素。因此,为了获得最优的个性化治疗,伴有低密度变化这种表型亚型的骨关节病应该被明确地分辨出来。研究四研究背景与目的：鉴于以上两个多态性位点的作用,为了促进对骨赘形成机制的研究,我们对伴有骨赘和不伴有骨赘的颞下颌关节骨关节病患者在rs1799750及rs1107946两个基因多态性位点的携带几率进行比较。同时,在大关节中已经有报道骨赘与疼痛及关节功能障碍有关联,而在同为滑膜关节的颞下颌关节中却鲜有相关报道,因此,该研究同时也涉及了骨赘的形成与颞下颌关节骨关节病临床症状的关联性问题。研究方法：近四年来,收集了632位在我院就诊的骨关节病患者,记录“明显骨赘(大于2mm长的骨赘)、骨赘的部位(功能面或非功能面)、疼痛(VAS>2.57±1.04)、是否张口受限(<3.5cm)”。其中,随机收集310位患者的全基因组DNA,经高分辨率溶解曲线法对这两个基因多态性位点进行分型。用卡方检验的方法统计伴和不伴骨赘的TMJ OA患者在以上两个位点的携带几率的差异；骨赘与疼痛、张口受限的相关性；同时统计骨赘部位与疼痛的关系。研究结果：发现有骨赘和没骨赘的TMJ OA患者在两个基因多态性位点的携带几率上无明显的统计学差异(P>0.05)；骨赘与疼痛有明显的相关性(P=0.002),有骨赘的关节伴随疼痛的几率是无明显骨赘的关节的1.673倍(OR==1.673, 95％CI=1.213-2.309)；而且其疼痛还与骨赘的部位有相关性(P=0.007),位于功能面的骨赘导致疼痛的几率是位于非功能面的2.046倍(OR=2.046, 95%CI=1.230.3.402).同时,骨赘对于张口受限也有一定关联(P=0.00001)；而且有明显骨赘者增加了患者出现张口受限的几率(OR=2.044,95%CI= 1.480-2.821)。结论：因此,伴有骨赘和不伴有骨赘的TMJ OA患者在rs1799750,rs1107946两个多态性位点的携带几率上无差异；骨赘可能导致疼痛及关节功能障碍。