目的：1.体外实验建立高转移潜能人肝癌细胞MHCC97H和低转移潜能人肝癌细胞MHCC97L的常氧和缺氧细胞模型,观察在常氧和缺氧条件下罗勒多糖对两种细胞的增殖能力、迁移能力和侵袭能力的影响,并进一步研究罗勒多糖对上皮间质转化(EMT)相关基因、蛋白的影响,探讨罗勒多糖抗肿瘤转移的作用机制。2.体内实验建立MHCC97H肝癌细胞裸鼠皮下荷瘤模型和walker-256细胞大鼠移植性肝癌模型,并对移植性肝癌大鼠进行肝动脉结扎术(HAL),造成肿瘤组织缺氧,观察罗勒多糖对两种模型肿瘤的影响,通过体内实验探讨罗勒多糖抗肿瘤转移作用与上皮间质转化(EMT)的关系。方法：1.采用浓度为200μmol·l-1的二氯化钻(CoCl2)诱导细胞体外缺氧,建立MHCC97H和MHCC97L细胞缺氧模型,细胞在常氧和缺氧条件下培养。常氧条件下将两种细胞分别分为正常组、罗勒多糖低剂量组、罗勒多糖中剂量组和罗勒多糖高剂量组,缺氧条件下将两种细胞分为正常组、缺氧模型组、罗勒多糖低剂量组、罗勒多糖中剂量组和罗勒多糖高剂量组,分别给予200、400和800μg·ml-1的罗勒多糖作用24小时,MTT法检测常氧和缺氧条件下罗勒多糖对细胞增殖能力的影响,划痕实验检测罗勒多糖对细胞迁移能力的影响,transwell小室实验检测罗勒多糖对细胞侵袭能力的影响,实时荧光定量PCR(RT-PCR)法检测罗勒多糖对细胞HIF-1 a、E-cadherin、β-catenin、 N-cadherin、Vimentin、 VMP1和ZO-1 mRNA表达水平的影响,Western-blot法检测罗勒多糖对细胞中HIF-1α、E-cadherin、β-catenin、N-cadherin、Vimentin、VMP1和ZO-1蛋白表达水平的影响。2.将MHCC97H细胞接种于裸鼠右侧肋腰部皮下,建立裸鼠皮下荷瘤模型,造模成功后根据肿瘤体积随机分为五组：模型组、索拉非尼组、罗勒多糖低剂量组、罗勒多糖中剂量组和罗勒多糖高剂量组,分别给予生理盐水、索拉非尼(50mg·kg-1·d-1)、低、中、高剂量罗勒多糖(100、200、400mg·kg-1 · d-1)灌胃,实验结束后,测量皮下瘤重量,观察各组肿瘤重量的变化,计算各药物的抑瘤率,实时荧光定量PCR(RT-PCR)法检测罗勒多糖对肿瘤组织中HIF-1α、 E-cadherin、β-catenin、 N-cadherin、Vimentin、VMP1和ZO-1 mRNA表达水平的影响,Western-blot法检测罗勒多糖对肿瘤组织中HIF-1α、E-cadherin、β-catenin、N-cadherin、Vimentin、VMP1和ZO-1蛋白表达水平的影响。3.采用walker-256细胞建立Wistar大鼠移植性肝癌模型,造模成功进行肝动脉结扎术(HAL),并将实验大鼠分为5组：模型组(不进行HAL)、HAL组、罗勒多糖低剂量组、罗勒多糖中剂量组和罗勒多糖高剂量组,手术成功后对模型组和HAL组给予生理盐水灌胃,罗勒多糖低、中、高剂量组给予罗勒多糖(75、150、300mg·kg-1·d-1)灌胃,实验结束后,测量肝脏肿瘤体积,计数腹腔肿瘤转移灶数目,实时荧光定量PCR(RT-PCR)法检测肝脏肿瘤组织中HIF-1α、E-cadherin、β-catenin、N-cadherin、 Vimentin、VMP1和ZO-1 mRNA表达水平,Western-blot法检测肝脏肿瘤组织中HIF-1α、E-cadherin、β-catenin、N-cadherin、Vimentin、VMP1和ZO-1蛋白表达水平。结果：1.浓度为200μmol·1的CoCl2作用MHCC97H和MHCC97L细胞24小时后,两种细胞中HIF-1α mRNA表达水平显著升高,与正常组比较有显著性差异(P<0.01)；在浓度为200μmol ·l-1的CoCl2的条件下,两种细胞的存活率分别为77.76%和87.76%,细胞存活率相对较高；因此确定缺氧模型的造模条件为200μmol·l-1的CoCl2作用细胞24小时。常氧条件下,罗勒多糖对MHCC97H和MHCC97L细胞的增殖能力无明显影响,各组细胞存活率都接近100%,与正常组比较差异无统计学意义；中剂量罗勒多糖对MHCC97H细胞的迁移能力有抑制作用,与正常组比较具有显著性差异(P<0.05),罗勒多糖对MHCC97H细胞的侵袭能力、MHCC97L细胞的迁移能力和侵袭能力均无明显作用,与正常组比较差异无统计学意义；罗勒多糖可以上调MHCC97H细胞中E-cadherin、ZO-1 mRNA和蛋白的表达水平以及VMP1的蛋白表达水平,下调Vimentin mRNA的表达水平,与正常组比较有显著性差异(P<0.05,P<0.01)；罗勒多糖可上调MHCC97L细胞中E-cadherin的mRNA和蛋白的表达水平,与正常组比较有显著性差异(P<0.05,P<0.01)。在缺氧条件下,MHCC97H和MHCC97L细胞的迁移和侵袭能力增强,与正常组比较有显著性差别(P<0.01)；罗勒多糖能抑制MHCC97H和MHCC97L细胞的增殖和迁移,并对MHCC97H细胞的侵袭能力具有抑制作用,与缺氧模型组比较具有显著性差异(P<0.01,P<0.05)；在缺氧条件下,MHCC97H和MHCC97L细胞中HIF-1α、N-cadherin、 Vimentin的mRNA和蛋白表达水及β-catenin的蛋白表达水平升高,E-cadherin、VMP1的mRNA和蛋白表达水平降低；罗勒多糖能下调MHCC97H细胞中HIF-1 α、 N-cadherin、Vimentin mRNA和蛋白以及β-catenin的蛋白表达水平,上调E-cadherin和VMPl的mRNA和蛋白表达水平；而在MHCC97L细胞中,罗勒多糖能上调E-cadherin的：mRNA和蛋白表达水平,下调HIF-1α的mRNA和蛋白表达水平。2. MHCC97H细胞荷瘤裸鼠模型实验结果显示,罗勒多糖中、大剂量组荷瘤裸鼠体重明显增加,与模型组比较有显著性差别(P<0.05,P<0.01)；低、中、高剂量罗勒多糖和索拉非尼对裸鼠皮下肿瘤的抑瘤率分别为25.15%、14.72%、46.63%和55.58%,与模型组比较均无显著性差异；罗勒多糖能下调肿瘤组织中HIF-1α、Vimentin、 N-cadherin的mRNA和蛋白以及β-catenin的蛋白表达,上调E-cadherin、VMP1、ZO-1的mRNA和蛋白的表达,与模型组比较有显著性差别(P<0.05,P<0.01)；索拉非尼能上调肿瘤组织中E-cadherin的mRNA和蛋白表达,下调β-catenin的蛋白表达,下调N-cadherin mRNA的表达以及Vimentin mRNA和蛋白的表达,与模型组比较有显著性差别(P<0.01)。3.大鼠移植性肝癌模型结果显示,肝动脉结扎术(HAL)能明显缩小大鼠肝脏肿瘤体积,与不进行HAL术的模型组比较有显著性差别(P<0.05),但HAL术后肿瘤腹腔转移灶数目(36±8个)明显增多,与模型组(11±3个)比较有显著性差别(P<0.01)；经HAL术后,肿瘤组织中HIF-1α、N-cadherin、Vimentin的mRNA和蛋白表达水平升高,β-catenin的蛋白表达水平升高,E-cadherin、VMP1的mRAN和蛋白表达水平降低；经罗勒多糖干预后,罗勒多糖中、高剂量组肿瘤腹腔转移数目明显减少,分别为(22±4个)和(19±6个),与HAL组比较有显著性差别(P<0.05,P<0.01)；罗勒多糖能下调肿瘤组织中HIF-1 α、N-cadherin Vimentin的mRNA和蛋白表达,下调β-catenin的蛋白表达,上调E-cadherin、VMP1的mRNA和蛋白表达,与HAL组比较有显著性差别(P<0.05,P<0.01)。结论：1.缺氧能促进MHCC97H和MHCC97L细胞EMT的发生。在缺氧条件下,MHCC97H和MHCC97L细胞中HIF-1α表达上调,同时细胞中与EMT相关的E-cadherin VMP1的表达下调,β-catenin、N-cadherin和Vimentin的表达上调,引起EMT的发生,使细胞的运动能力和侵袭能力增强,加速了肿瘤的侵袭和转移。2.罗勒多糖能抑制MHCC97H和MHCC97L细胞EMT的发生,这一作用与肿瘤缺氧微环境密切相关,并具有细胞差异性,对转移能力强的MHCC97H细胞表现出更显著的作用。对MHCC97H细胞,罗勒多糖能通过调节缺氧条件下HIF-1α的表达以及EMT相关的E-cadherin、β-catenin、N-cadherin、Vimentin、VMP1的表达,影响EMT的发生,抑制肿瘤细胞的侵袭和运动能力；而对MHCC97L细胞,罗勒多糖仅通过调节缺氧条件下HIF-1α的表达和EMT相关的E-cadherin的表达,抑制肿瘤细胞的运动能力,对侵袭能力无明显作用。3.罗勒多糖和索拉非尼都能通过抑制EMT起到治疗肿瘤的作用,但作用机制不同。罗勒多糖主要是通过改善肿瘤缺氧微环境,下调HIF-1α的表达,进而调节EMT相关的E-cadherin、β-catenin、N-cadherin、Vimentin、VMP1、ZO-1表达,抑制EMT的发生；而索拉非尼不能改善肿瘤缺氧微环境,但其能通过调节E-cadherin、β-catenin和Vimentin的蛋白表达起到抑制EMT的作用。4.罗勒多糖能从多个方面对肿瘤产生影响,从而起到抗肿瘤转移的作用。结合本实验和前期研究结果发现,罗勒多糖能改善肿瘤缺氧微环境、抑制肿瘤细胞EMT的发生、增强机体免疫力进而改善实验动物生存状态,其抗肿瘤转移是多靶点、多途径共同作用的结果。