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慢性疼痛是指疼痛持续时间较长,超过受伤愈合的时间而与引起持续疼痛的慢性病理过程有关,或经数月或数年疼痛复发。根据发生的原因不同,慢性疼痛可分为免疫炎症痛、神经病理性痛、癌症痛、糖尿病性神经痛、带状疱疹后遗神经痛、艾滋病相关神经痛和腰背痛等。慢性疼痛是临床上最常见的症状之一,严重影响患者的生活质量。目前临床上治疗慢性疼痛主要包括阿片类药,局部麻醉药如利多卡因,三环抗抑郁药如阿米替林和抗癫痫药如加巴喷丁和普瑞巴林。但是由于对慢性疼痛较低的认知度,市场上现有的多数产品对于慢性疼痛的治疗针对性较低,或给药不方便,对大部分患者无效或只能有限地缓解疼痛,同时可能引起许多不良反应包括吗啡镇痛耐受性。因此,发现安全有效、无耐受成瘾性的新型治疗慢性疼痛药物和新靶点分子及其信号通路,是当前神经生物学和新药研究热点。GLP-1受体是由463个氨基酸组成的跨膜蛋白,属于蛋白质家族B/G蛋白偶联受体。它具有调节内源性的GLP-1和胃泌酸调节素合成和分泌的作用。我们实验室前期工作首次发现脊髓和皮下给予GLP-1受体肽类激动剂GLP-1和艾塞那肽能够剂量依赖式地抑制福尔马林诱导的II相疼痛、肿瘤疼痛、神经源性疼痛和糖尿病疼痛,而不影响急性疼痛。我们实验室进一步发现,激动小胶质细胞上的GLP-1受体,导致镇痛递质β-内啡肽释放产生镇痛作用。我们实验室从而提出假说,脊髓小胶质细胞GLP-1受体/β-内啡肽是一条新的镇痛靶点通路。采用化学结构与GLP-1和艾塞那肽不同尤其是非肽类GLP-1受体激动剂,有助于进一步证实脊髓小胶质细胞GLP-1受体/β-内啡肽镇痛通路假说。GLP-1和艾塞那肽是肽类大分子药物(分子量约为3000-4000 Da),难以穿过血脑屏障,应用受到限制。GLP-1受体非肽类激动剂具有分子量小,可能可以口服,跨越血脑屏障等优点,更具有潜力开发成为临床应用的镇痛药物。WB4-24为GLP-1受体激动剂Boc5的衍生物,分子量约1000 Da,可能是目前最有效的非肽类正构型GLP-1受体激动剂(活性约在0.2μM),并具有显著的降低血糖、体重和饮食作用。藏药独一味水提物及其有效成分山栀苷子甲酯(环烯醚萜苷类化合物)可以抑制福尔马林疼痛,神经源性疼痛和骨癌痛,且其镇痛作用可被exendin9-39所拮抗。山栀苷子甲酯分子量约300da左右,一倍证明为glp-1受体正构型激动剂。。据此,我们在本课题中研究wb4-24和山栀子苷甲酯镇痛作用及其作用机制。我们首先探讨glp-1受体非肽类激动剂wb4-24对炎性疼痛的镇痛作用,观察给予wb4-24后对模型动物的热辐射痛和机械性疼痛的影响,并深入研究wb4-24通过激动小胶质细胞中的glp-1受体,对β-内啡肽的释放和炎性因子释放的影响。我们接着探讨山栀子苷甲酯对神经源性疼痛的镇痛作用,观察山栀子苷甲酯对神经源性疼痛模型动物的机械性疼痛的影响,并深入研究其镇痛作用机制是否与激动小胶质细胞p38mapk信号转导通路和释放β-内啡肽相关,并进一步探讨了山栀子苷甲酯自身镇痛耐受和对吗啡交叉耐受。动物模型选用福尔马林,角叉菜胶和完全弗氏佐剂(cfa)引起的急性或慢性炎性疼痛模型和神经源性疼痛模型。实验动物造模成功后,应用热辐射痛仪或机械痛测痛仪测量疼痛模型的热辐射痛或机械性疼痛。同时应用实时定量pcr或荧光免疫试剂盒测定β-内啡肽在细胞上清液或和组织中的表达量和释放量,炎性因子的释放也应用实时定量pcr进行测定。原代细胞培养过程中,应用了改进的小胶质细胞、神经元和星形胶质细胞分离的技术。在小胶质细胞配体结合实验中,wb4-24与exendin(9-39)-fitc表现出特异性地竞争性结合,在表达人glp-1受体的hek293细胞和表达大鼠glp-1受体的pc12细胞中,wb4-24可以剂量依赖式地使glp-1-fitc量效曲线右移。鞘内注射wb4-24(0.3,1,3,10,30和100μg),剂量依赖式对福尔马林,角叉菜胶,和完全弗氏佐剂(cfa)引起的急性或慢性炎性疼痛表现出良好的镇痛作用,疼痛抑制率大约为60-80%。但鞘内注射wb4-24对福尔马林疼痛急性期却没有影响。皮下注射wb4-24同样对完全弗氏佐剂(cfa)引起的炎性疼痛具有良好镇痛作用,热辐射痛和机械性疼痛的镇痛效率分别为52.6%和48.6%。wb4-24激动glp-1受体引起小胶质细胞β-内啡肽释放,其β-内啡肽释放作用可以完全被小胶质细胞抑制剂米诺环素所拮抗,但wb4-24可以通过激动小胶质细胞glp-1受体对炎性疼痛产生镇痛作用,却对小胶质细胞炎性因子的释放没有影响。另一方面,鞘内注射山栀子苷甲酯(sm)对神经源性疼痛也可以产生剂量依赖式的镇痛作用,ed50为40.0μg,最高抑制率为48.8%。wb4-24和山栀子苷甲酯的镇痛作用均可以完全被小胶质细胞抑制剂米诺环素,β-内啡肽抗血清,μ-阿片受体拮抗剂CTAP拮抗,但不能被κ-阿片受体拮抗剂nor-BNI和δ-阿片受体拮抗剂那曲吲哚所拮抗。此外,山栀子苷甲酯也可以激动小胶质细胞,使小胶质细胞释放β-内啡肽量升高,山栀子苷甲酯的镇痛作用和刺激β-内啡肽的释放作用完全被p38MAPK抑制剂SB203580而不能被JNK抑制剂SP600125和ERK抑制剂U0126所拮抗。在镇痛耐受实验中,连续7天给予山栀子苷甲酯不引起自身镇痛耐受,与吗啡合用亦不产生交叉镇痛耐受。上述结果证实了GLP-1受体非肽类激动剂WB4-24和山栀子苷甲酯对福尔马林,角叉菜胶,和完全弗氏佐剂(CFA)引起的急性或慢性炎症疼痛和神经源性疼痛具有良好的镇痛作用,并且长期连续给予山栀子苷甲酯可以抑制神经源性疼痛,既不会产生自身耐受也不会产生吗啡交叉耐受,WB4-24和山栀子苷甲酯都是可以通过激活脊髓小胶质细胞释放β-内啡肽,来抑制炎性疼痛或神经源性疼痛。此外,GLP-1受体非肽类激动剂WB4-24和山栀子苷甲酯均是通过激活小胶质细胞表面的GLP-1受体,作用于p38 MAPK信号通路,引起β-内啡肽的释放选择性作用与μ-阿片受体这条通路来产生镇痛作用,进一步验证了GLP-1受体是潜在的治疗慢性疼痛靶点分子。