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研究目的本研究以Aβ1-42诱导的AD模型大鼠为对象,用艾灸的方法,观察艾灸热敏与否对AD模型大鼠认知行为、海马神经元的形态、Aβ代谢转运酶的影响,探讨热敏灸对AD模型大鼠的干预效果及作用机制。研究方法本实验研究采用雄性SD大鼠为对象,适应3d后,将其随机分为空白对照组(A组),假手术组(B组),其余予以Aβ1-42进行诱导来造模。AD模型建立方法:使用3%戊巴比妥钠对大鼠进行麻醉,麻醉后剃除其位于颅顶部位的毛发以便后续进一步手术,再采用脑立体定位仪固定大鼠脑部,并用碘伏对大鼠的伤口消毒,将其皮下肌肉组织与皮毛分离后,用洁净的干棉球拭去其残留血迹,将其颅骨中线及前囟暴露。参照包新民《大鼠脑立体定位图谱》,侧脑室注射位点以前囟为基点,后移0.8mm,中线旁开1.2mm,以牙科钻钻开颅骨,用10μL微量注射器自脑表面垂直向下进针4 mm,回针1mm,预留一定的注射空间,左右两侧分别缓慢注入5μL的Aβ1-42(含5μg Aβ1-42),5min内注射完毕,注射后留针5min以保证溶液充分弥散后缓慢撤针。手术尾声时以骨蜡密封手术所造成的骨窗,并随即以青霉素在其局部进行喷洒以达到消毒的目的,最终将事先分离的皮肤进行缝合。值得注意的是,在整个手术过程内,接受手术的大鼠体温应当保持在36.5-37.5℃的恒定范围之内。通过水迷宫实验进一步筛选出造模成功的AD模型大鼠,并将其分为AD模型组(C组),阳性对照组(G组),其余大鼠给予艾灸治疗。艾灸组每天艾灸1次,每次艾灸40分钟;阳性对照组每天给予药物1次;治疗共持续28天。根据艾灸热敏程度自然分为艾灸热敏组(D组)、艾灸不热敏组(E组)、艾灸迟发热敏组(F组)。艾灸热敏组(D组):艾灸治疗过程中平均尾温升高>1℃;在采取艾灸手段对AD模型大鼠进行治疗之前,按照实验大鼠腧穴图谱中的定位,事先将大鼠“大椎”穴处的毛发剃去。整个治疗过程之中,将艾条(江西中医药大学附属医院,规格:直径1cm,长12cm,)垂直悬空于“大椎”穴约3 cm的高处予以温和灸,1次/日,每次持续灸40min,共28天。同时将室温控制于25±2℃的恒定温度。艾灸开始前,大鼠被置于特制鼠笼中安静30分钟。用医用红外额温计(调为物温模式)分别在艾灸准备开始前及艾灸开始后每5分钟测量一次大鼠中段的尾温,直至第40分钟,艾灸结束。大鼠尾温为同一时间点3次测量的平均温度。艾灸不热敏组(E组):艾灸治疗过程中平均尾温升高≤1℃;操作步骤与艾灸热敏组相同。艾灸迟发热敏组(F组):艾灸治疗过程中前7天平均尾温升高≤1℃,后随着治疗时间的延长,逐渐出现平均尾温升高>1℃;操作步骤与艾灸热敏组相同。阳性对照组(G组):给予模型大鼠多奈哌齐0.5mg/kg/d腹腔注射。在28d疗程结束后,以水迷宫法对每组大鼠的行为学展开观测。并采取HE组织切片染色法对每组大鼠海马区的神经元形态与排列情况进行观测。采用ELISA法检测各组大鼠脑组织中α-分泌酶、β-分泌酶、γ-分泌酶含量。同时采用Western Blot法对每组大鼠海马组织中的IDE、NEP、ECE-1、ACE2、LPL、Apo E、LRP1、RAGE和RAP蛋白表达情况进行检测。研究结果1.水迷宫法观测结果:假手术组大鼠与对照组相比,水迷宫逃避潜伏期、第六天穿越次数、平台象限时间占比均无显著差异。与模型组相比,艾灸热敏组第1~5d的逃避潜伏期降低明显,第六天水迷宫穿越次、平台象限时间占比均显著升高,结果同阳性对照组;艾灸不热敏组与艾灸迟发热敏组大鼠水迷宫逃避潜伏期变化无统计学意义,艾灸迟发热敏组大鼠水迷宫第六天水迷宫穿越次数与平台象限时间占比显著性升高,艾灸不热敏组大鼠水迷宫平台象限时间占比显著升高。与艾灸不热敏组比较,艾灸热敏组的逃避潜伏期明显缩短,第六天水迷宫穿越次数和平台象限时间占比均显著性升高,而艾灸迟发热敏组逃避潜伏期无明显改变,第六天水迷宫穿越次数和平台象限时间占比均显著性升高。2.HE组织切片染色法观测结果:对照组与假手术组大鼠的海马神经元及其胶质细胞未出现异常现象且其排列均匀整齐,细胞质丰富,无间质出血,无坏死。而AD模型组大鼠的脑组织出现严重损伤的现象,具体表现为其神经元细胞的排列出现一定程度上的紊乱,且其细胞形态出现严重的肿胀及变形,同时神经元大量丢失,严重者出现神经元大量死亡,并伴随有部分细胞核出现溶解、固缩的现象。与AD模型组大鼠相比,进行治疗后,各组大鼠的脑组织损伤出现减轻的现象,其中艾灸热敏组和阳性对照组减轻明显,脑组织形态较正常,无炎细胞浸润,排列整齐;迟发热敏组的细胞紊乱和炎症细胞浸润程度也有所减轻;艾灸不热敏组无明显改善。HE半定量评分显示:与模型组相比,艾灸热敏组、艾灸迟发热敏组与阳性对照组大鼠脑组织HE半定量评分显著下降,艾灸不热敏组大鼠脑组织HE半定量评分变化无统计学意义。与艾灸不热敏组比较,艾灸热敏组和艾灸迟发热敏组大鼠脑组织HE半定量评分显著下降,差异有统计学意义;且艾灸热敏组优于艾灸迟发热敏组。3.ELISA法测定结果:与对照组比较,模型组大鼠脑海马组织中α-分泌酶、β-分泌酶、γ-分泌酶含量均显著升高;与模型组比较,艾灸热敏组、艾灸迟发热敏组和阳性对照组大鼠脑组织中β-分泌酶、γ-分泌酶含量均有不同程度的降低,α-分泌酶的含量均有不同程度的升高,而艾灸不热敏组α-分泌酶无升高,β-分泌酶、γ-分泌酶无下降,差异无统计学意义。与艾灸不热敏组比较,艾灸热敏组α-分泌酶的含量明显升高,β-分泌酶、γ-分泌酶含量明显降低;艾灸迟发热敏组β-分泌酶含量明显降低,γ-分泌酶含量下降无统计学意义。4.WB结果显示:与空白对照组大鼠比较,假手术组的大鼠海马组织中的NEP、IDE、ECE-1、ACE2、LPL、Apo E、LRP1、RAGE和RAP蛋白的表达水平均无显著变化,而模型组中IDE、NEP、ECE-1、Apo E、ACE2和LRP1蛋白表达下降明显,RAGE和RAP蛋白的表达水平均呈现出显著的升高现象。而与此同时,LPL蛋白表达水平并无呈现出明显的变化趋势。较之于AD模型组大鼠,艾灸热敏组、艾灸迟发热敏组和阳性对照组的NEP、IDE、ECE-1、ACE2、Apo E和LRP1蛋白的表达水平均呈现出显著的升高现象,且海马组织中RAP、和RAGE蛋白表达水平均明显下降,艾灸不热敏组的大鼠脑海马组织中NEP、ECE-1、ACE2、LPL、Apo E、LRP1和RAP蛋白的表达水平均无显著变化,IDE表达显著升高,RAGE表达显著降低。与艾灸不热敏组比较,艾灸热敏组和艾灸迟发热敏组NEP、ECE-1、ACE2、Apo E、LRP1蛋白表达水平均显著升高,RAP蛋白表达水平均明显下降,而RAGE蛋白表达下降不明显,艾灸热敏组IDE蛋白表达明显升高,艾灸迟发热敏组IDE蛋白表达升高不明显。结论1.热敏灸干预能够提高AD模型大鼠的空间学习和记忆能力。2.热敏灸干预能提高AD模型大鼠的空间学习和记忆能力,可能与其改善AD模型大鼠海马区神经元及胶质细胞的排列结构和形态有关。3.热敏灸干预能提高AD模型大鼠的空间学习和记忆能力,可能与其升高AD模型大鼠海马组织中α-分泌酶的含量,降低β-分泌酶、γ-分泌酶含量从而使Aβ沉积减少有关。4.热敏灸干预能提高AD模型大鼠的空间学习和记忆能力,可能与其调节Aβ转运代谢相关蛋白有关。