研究背景临床上,眼科多种疾病的病理改变均为视网膜的供血不足,进而造成视神经节细胞(RGCs)的损伤及其轴突的损害,并最终以RGCs的凋亡为主要表现。目前临床对造成RGCs凋亡的疾病没有很好的治疗方法,迫切需要有效的新方法、新手段。体外培养原代RGCs是研究多种眼科疾病常用的方法,可对疾病发展、转归和用药情况、发生机制进行很好观察、研究。阿克苷(Acteoside)是一种天然多酚类物质,属苯丙素苷类(phenylpropanoid glycosides PPGs),为云南苦丁茶的主要成分,含量达2.1%。该植物分布于云南东北昭通地区海拔1000一1500米的亚热带阔叶林区,是该地区的特有经济作物,物廉价美。近年来,诸多文献报道具有抗氧化活性的天然多酚类物质阿克苷,对于急性缺血性中枢神经元损伤、慢性进行性中枢神经元变性均具有较强的神经保护作用。同时也有研究报道在动物模型上观察到阿克苷对视神经夹持损伤的RGCs有保护作用。为了进一步对阿克苷的视神经保护作用进行观察研究,我们进行该实验,力求能为临床带来新的治疗思路。目的体外RGCs培养模型的建立,以此为依托观察阿克苷对RGCs损伤的保护作用。1、建立正常体外SD大鼠RGCs培养模型2、建立体外低血清培养SD大鼠RGCs损伤模型3、阿克苷对体外正常培养SD大鼠RGCs安全性观察4、阿克苷对低血清所致SD大鼠RGCs损伤的保护作用观察方法1、第一部分建立正常体外SD大鼠RGCs培养模型：取材出生1-3天的SD乳鼠16只视网膜组织,经0.2%胰蛋白酶(终浓度)消化,制成细胞混悬液,接种于培养板中,在37℃,5%CO2条件下培养,第72小时第一次对细胞培养液进行1/3更换,并加入阿糖胞苷(终浓度lOumol/L)抑制杂细胞,第96小时观察细胞形态、进行Thyl.1特异性荧光染色鉴定并计数,确定细胞类别、计算细胞纯度。2、第二部分低血清培养SD大鼠RGCs损伤模型建立：取用第一部分建立的正常体外RGCs培养模型,设定6个血清浓度梯度10%,7.5%,5%,2.5%,1.25%,0%,进行细胞培养。于培养12h、24h对细胞形态进行观察,并使用WST-8(cck-8)方法检测细胞活性。3、第三部分阿克苷对体外原代培养SD大鼠RGCs的安全性观察：取第一部分建立的正常体外RGCs培养模型,设定6个分组——A组(不加药组)、B组(5mg/ml)、C组(3mg/ml)、D组(1mg/ml)、E组(0.5mg/ml)、F组(PBS组),按照1：50的体积比分别加入常规培养液、相应浓度阿克苷、PBS,在24h、48h分别对各组细胞进行免疫组化染色、计数、WST-8(cck-8)方法细胞活性检测。4、第四部分阿克苷对低血清所致SD大鼠RGCs损伤的保护作用观察：取材出生1-3天的SD乳鼠32只,使用第二部分方法12h建立体外低血清RGCs损伤模型；使用第三部分所得1mg/ml阿克苷浓度,加入低血清损伤RGCs模型中,分别在加药作用12h、36h对各组细胞进行如下观察(1)光镜下形态学观察(2)电镜下细胞微细结构的观察(3)WST-8 (cck-8)方法细胞活性检测(4)免疫组化染色、细胞计数(5)Western Blot免疫印迹法检测GAP-43、Bcl-2、Bax蛋白表达水平。结果1、第一部分取材所制备单细胞混悬液密度3.0×106/ml,接种当时光镜下见细胞单个、分散、密度均匀；从接种到生长7天,细胞都呈正常生长迹象,轴突长出、拉丝成网；Thy1.1特异性荧光染色鉴定为RGCs,结合DAPI核染色计数,RGCs所占百分率： 92.3%。2、第二部分不同浓度血清培养观察：(1)不同血清浓度培养12h、24h光镜下观察：正常生长形态RGCs随血清浓度降低而减少、细胞数量也出现减少趋势,肉眼可见凋亡形态；(2)WST-8 (cck-8)细胞活性检测：培养12h和24h时,2.5%,1.25%,0%浓度组细胞活性降低明显(p<0.05)：而5%、7.5%及10%血清浓度组细胞活性未见差异(p>0.05)。两个时间点比较,各组细胞自身比较活性无差异。3、第三部分按照等体积比(1：50)加用不同浓度阿克苷观察：(1)免疫组化染色：加药后24h B组(5mg/ml)细胞的着色程度较其余组浅;48h B组(5mg/ml)细胞的密度较其余组低；(2)免疫组化细胞计数：加药24h,各组间均无明显数量差异(p>0.05)；加药48h,B组(5mg/ml)细胞减少(p<0.05)；(3)WST-8 (cck-8)细胞活性检测：加药24h和48h,B组(5mg/ml)细胞活性均减低(p<0.05),其余组无明显差异(p>0.05)。4、第四部分1mg/ml阿克苷按照1：50体积比加入低血清RGCs损伤模型中作用12h、36h(1)光镜下观察：不加药组和PBS组的正常生长形态RGCs少见,加药组RGCs正常形态明显、轴突增多；(2)电镜显示：不加药组和PBS组均显示线粒体空泡、细胞膜及核膜皱缩不光滑、微细结构不易观察到；加药后随时间增加,细胞膜及核膜的光滑度、完整性改善、胞内空泡减少,部分微细结构明显；(3)WST-8 (cck-8)细胞活性检测：加药12h和36h,细胞活性均有提高(p<0.05)；并且,随用药时间增加,细胞活性增高有统计学意义(p<0.05)；(4)免疫组化染色——加药组细胞着色较深；免疫组化细胞计数——随时间增加,加药作用使RGCs数量增加(p<0.05);(5) Western Blot免疫印迹法检测蛋白相对表达量：a. GAP-43相对表达量：加药12h、36h,GAP-43蛋白量都有增加(p<0.05)；而且两个时间点比较GAP-43的蛋白量也是增加的(p<0.05)。b. Bcl-2相对表达量：加药12h、36h,Bcl-2蛋白量都有增加(p<0.05)；而且两个时间点比较Bcl-2的蛋白量也是增加的(p<0.05)。c. Bax相对表达量：加药12h、36h,Bax蛋白量都有下降(p<0.05)；而且两个时间点比较Bax的蛋白量也是下降的(p<0.05)。d. Bcl-2/Bax值：12h时间组,不加药组为0.964979,加药组为2.061404,加药组／不加药=2.14；36h时间组,不加药组0.977391、加药组4.052812,加药组／不加药组=4.15。加药组在两个时间点,Bcl-2/Bax值均大于1,并随时间增加而增加,反映Bcl-2的相对量超过Bax,提示细胞对凋亡的抵抗性增强。结论1、Thy1.1特异性鉴定表明培养细胞为RGCs,结合DAPI染色计数显示RGCs占比率为92.3%,体外培养RGCs模型成立。2、通过利用改变完全培养基的配液成分,模拟细胞生长微环境的变化,经过形态学观察和细胞活性的检测,确认1.25%胎牛血清培养12h,低血清培养RGCs的损伤模型成立。3、通过对RGCs活性及数量的测定,最终确立加入体积比1：50时,0.5mg/ml、 lmg/ml、3mg/ml的阿克苷浓度是具有安全性的。4、通过细胞形态、微细结构、细胞活性、免疫组化染色计数观察,以及GAP-43、Bcl-2、Bax蛋白表达量的检测、Bcl-2/Bax比值的变化来看,几方面的结果都相互符合,具有一致性,证明阿克苷在低血清造成的RGCs损伤模型中对RGCs具有保护作用,不仅对轴突的再生起到作用、对细胞的对抗凋亡的抵抗性也有增强。