基因重排是流感病毒变异与演化的方法之一,不同流感病毒之间基因片段的重排可以产生更适应于宿主的新型病毒,历史上造成流感大流行的毒株多数是基因重排产生的病毒,但是影响流感病毒重排的分子因素尚不是十分清楚。最近,在蝙蝠中发现了H17N10与H18N11两种新型的蝙蝠流感病毒。研究表明,蝙蝠流感病毒与A型流感病毒的演化关系最近,蝙蝠流感病毒之间,即H17N10与H18N11之间可以发生基因重排,但是它们很难和普通的A型流感病毒之间发生重排。本研究以蝙蝠H17N10与H9N2流感病毒作为模型,研究影响流感病毒基因重排的分子因素及其对病毒生物学特性影响禽类作为A型流感病毒的主要宿主之一,蝙蝠流感病毒是否对禽类存在威胁,在禽类体内的适应能力、感染能力和传播特性尚不清楚。在本研究中,利用反向遗传技术以H17N10或H18N11病毒的内部基因作为骨架,成功拯救了两株重组蝙蝠流感病毒cH9cN2/H17和cH9cN2/H18,其中HA和NA基因除包装信号来源于蝙蝠流感病毒表面基因,其ORF序列来源于H9N2病毒的表面基因,以及重组病毒的全部内部基因序列均是来源于蝙蝠流感病毒。我们比较了重组蝙蝠流感病毒cH9cN2/H17、cH9cN2/H18与H9N2野生型病毒（H9N2-wt）在禽细胞中生长特性,结果显示,与H9N2-wt相比,cH9cN2/H17和cH9cN2/H18在禽细胞中的复制能力较差。本研究系统评估了这三株病毒在鸡体内的复制与水平传播能力,结果显示H9N2-wt可以在禽体内有效复制与水平传播,而cH9cN2/H18与cH9cN2/H17在鸡体内的复制水平较低,cH9cN2/H18可以在鸡之间进行水平接触传播,而cH9cN2/H17不能发生接触传播。Mini-genome assay结果显示H17N10与H18N11的核糖核蛋白体（viral ribonucleoproteins,vRNPs）的聚合酶活性在禽细胞中显著低于H9N2-wt的vRNPs。禽IFN-β启动子激活抑制实验结果显示,在禽细胞中,H9N2病毒NS1蛋白抑制禽IFN-β启动子激活的能力强于两株蝙蝠流感病毒的NS1蛋白,而H18N11的NS1蛋白抑制禽IFN-β激活的能力强于H17N10的NS1蛋白,上述结果说明重组蝙蝠流感病毒对禽的适应性差于H9N2-wt,而H18N11内部基因适应禽类能力可能强于H17N10病毒。为进一步了解影响蝙蝠流感病毒与A型流感病毒重排的分子因素,利用构建的重组cH9cN2/H17和H9N2流感病毒的反向遗传系统,互相替换单个基因片段拯救病毒,实验结果显示重组蝙蝠流感cH9cN2/H17病毒与H9N2流感病毒基因组之间不能重排。已有研究显示位于流感病毒基因片段两端的包装信号区域对流感病毒基因组选择性包装至关重要,本研究也发现,将H9N2的HA与NA基因的包装信号区域替换为H17N10或者H18N11表面基因的对应区域后,均可成功拯救出重组流感病毒（cH9cN2/H17与cH9cN2/H18）,说明包装信号区域对流感病毒重排,特别是对于表面基因而言非常重要。为进一步研究包装信号序列对蝙蝠流感病毒与H9N2病毒内部基因重排的影响,分别将两种病毒的NP基因的包装信号区域进行替换,相互替换包装信号的NP基因不能与两种病毒发生重排,说明对于内部基因而言,除包装信号外还有其他因素影响病毒重排。包装信号区域包含了5’与3’端流感病毒基因启动子区域,此区域是vRNPs识别并开始转录子代病毒基因组的重要区域,为了进一步研究包装信号区域影响流感病毒重排的分子机制,我们构建了含有蝙蝠流感病毒与H9N2的PB2、PB1、PA、HA、NA、NP基因启动子的mini-genome聚合酶活性检测系统,评估了H17N10与H9N2的vRNPs对不同来源启动子的识别转录效率。结果显示对于大部分基因而言,两种病毒vRNPs识别自身来源启动子的效率高于异源启动子,对启动子识别的效率差异可能是影响蝙蝠流感病毒与H9N2病毒重排的重要因素之一。最新研究发现流感病毒8个RNA基因片段之间存在通过碱基互补介导的互作网络,这对病毒选择性包装8个基因片段至关重要。为进一步研究基因之间互补序列对病毒不同基因片段选择包装的影响,利用重组蝙蝠流感病毒作为模型,利用生物学软件分析其8个基因序列之间的互补序列,发现不同基因片段之间存在数量不等的互补序列。为验证互补序列对病毒基因片段包装的影响,将NP基因上与其他片段之间存在的互补序列进行同义突变,利用反向遗传技术拯救突变病毒失败,说明互补序列对病毒的拯救至关重要。为了说明突变NP是否影响病毒对基因片段的包装效率,利用real time RT-PCR与病毒包装出芽实验,将表达突变NP与含有其他7个基因的反向遗传质粒共转染293T细胞,收集上清中包装出芽的病毒颗粒,分析病毒颗粒中8个基因片段的含量。结果显示,与NP未突变病毒比较,NP突变后,包装出芽的NP突变病毒颗粒中PB1、NP、NS三个基因片段的含量明显少于其他基因,说明NP基因中存在的与其他基因的互补序列对病毒基因组的包装至关重要。为了拯救到活病毒,将NP分成3个区域分别进行突变并拯救病毒,可以拯救到三个NP突变病毒。接下来real time RT-PCR与病毒出芽实验结果显示NP分成3个区域突变后仍然可以影响不同基因的包装效率,尤其是NP本身基因的包装效率明显低于其他基因。对于含有相同TCID₅₀病毒滴度的3个NP突变病毒粒子中包装的8个基因片段水平分析结果显示,其中两个NP突变病毒包装的8个基因片段显著多于野生型病毒,可能由于NP突变影响了病毒对不同片段的包装效率,导致出芽病毒中基因组“残缺型”增多,含有8个基因片段的有活性病毒粒子少于野生型病毒,所以在相同TCID₅₀病毒滴度下,NP突变病毒含有比野生型病毒更多的病毒粒子以及更多的基因片段。总而言之,重组蝙蝠流感病毒不同基因之间的互作序列对其选择性包装8个基因片段具有重要的作用,在重排发生后,子代病毒应该更倾向于重排与自身基因片段存在更强互作能力的基因。流感病毒的vRNPs主要负责流感病毒基因组的转录与复制,不同来源流感病毒的聚合酶蛋白之间的兼容性不同,影响病毒基因片段之间的重排。然而影响不同聚合酶蛋白之间兼容性的分子机理尚不清楚。根据已经解析的蝙蝠流感病毒RNPs蛋白间的互作关系与功能区域,我们研究了vRNPs蛋白之间的兼容性对病毒重排的影响。利用mini-genome方法,发现H17N10与H9N2病毒的NP蛋白具有良好的兼容性,互换后对聚合酶影响较小。然而互换PB2、PB1、PA蛋白后导致聚合酶水平显著下调,说明这三个聚合酶蛋白的兼容性影响H17N10与H9N2病毒之间的重排。为了揭示造成这一现象的分子机制,我们选择PB1作为研究对象,构建一系列H17N10与H9N2的PB1杂合基因,mini-genome结果显示PB1 N端与PA蛋白的互作区域对两种病毒聚合酶之间兼容性有较大的影响。另外,PB1的vRNA与cRNA结合区、聚合酶“finger”区域对两种病毒聚合酶之间的兼容性也存在较大的影响,这可能与H17N10与H9N2基因片段的启动子序列存在差异有关。综上所述,启动子序列、包装信号、病毒基因片段之间的互作、聚合酶蛋白之间互作以及vRNPs识别病毒基因启动子的效率都是影响不同病毒基因片段之间重排的重要因素。