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L-苯丙氨酸（L-phenylalanine），作为人体必需的氨基酸之一，在食品工业中，主要用作新型食品添加剂阿斯巴甜（Aspartame，L-Asp-L-Phe-Me）的合成原料。随着世界市场每年对阿斯巴甜需求量的增加，L-Phe的合成工艺已成为当前生物化工领域研究与开发的热点。利用苯丙氨酸解氨酶（phenylalanineammonia-lyase，PAL，E.C.4.3.1.5）的逆向催化特性来生产L-Phe是一条主要的路线，关键问题在于怎样低成本而又高效地获得苯丙氨酸解氨酶PAL。本研究在毕赤酵母GS115和大肠杆菌BL21中构建了PAL基因工程菌，期望通过微生物发酵实现苯丙氨酸解氨酶PAL的工业化生产。研究结果如下: 1)克隆到了来自膜英黄芪和大豆的PAL基因的ORF。 2)构建了克隆载体pUCm-T-PAL并转化到了大肠杆菌DH5α中。 3)PAL基因的生物信息学分析结果。 利用DNAStar软件和NCBI对测序序列进行分析，结果如下:来自于膜英黄芪的基因ORF长度为2157bp，编码718个氨基酸，蛋白相对分子质量为78KD，等电点为6.04，所扩增到的基因其核酸序列及氨基酸序列均与膜荚黄芪苯丙氨酸解氨酶EF567076.1有99％的一致性;来自于大豆的基因ORF长度为2142bp，编码713个氨基酸，蛋白相对分子质量为77.6KD，等电点为6.31，所扩增到的基因其核酸序列及氨基酸序列均与大豆苯丙氨酸解氨酶AK245610.1有100％的一致性。 4)利用体外同源重组技术构建了表达载体pPIC9K-AmPAL, pPIC9K-GmPAL和pET32a-AmPAL。 5)获得了基因工程菌GS115-pPIC9K-AmPAL，GS115-pPIC9K-GmPAL和BL21-pET32a-AmPAL。 基因工程菌诱导表达后，对其产物进行分析，结果如下:①重组菌BL21-pET32a-AmPAL与负对照相比，25℃时，1mmoL/L IPTG诱导1h后，其SDS-PAGE电泳图谱在96kD(包括载体上部分氨基酸序列)处有一条明显的特异性蛋白条带，大小与预期PAL蛋白一致，但是酶活性不高，只有5U;②重组菌GS115-pPIC9K-AmPAL，1％甲醇诱导48h后，其SDS-PAGE电泳图谱在78KD位置处出现一条特异性条带，其大小与预期值一致，并且随着诱导时间增加，PAL表达量越来越大，诱导120h后，表达量达到最大。利用Q-Sepharose FF蛋白纯化柱对总蛋白进行纯化，获得了较纯的苯丙氨酸解氨酶PAL。Bradford法测得纯化后PAL质量浓度为0.08mg/mL，含量占总蛋白的11.54％，最高比活达到4270U/mg。