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银杏是著名的活化石植物,具有很高的药用、食用和科研价值。银杏叶绿素在秋季大规模降解时叶色变黄明显,叶绿素含量也与黄酮含量呈现相关性。因此研究银杏叶绿素降解酶有重要的科研和应用价值。本论文主要分为四部分:外源因子对离体叶片的叶绿素降解和酶活性的影响:用银杏叶为材料,采用叶圆片试验系统,添加植物激素、碳源、氮源、金属离子,定时取样测定叶绿素含量以及叶绿素酶活性,考察外源因子对离体银杏叶片中叶绿素酶的活性影响。结果表明:叶绿素含量与银杏叶绿素酶活性并不总是成反比,不同的因素处理得到的二者的相互关系不同。对于植物生长调节物质(6-BA),随着叶绿素含量的增加,叶绿素酶活性保持在较高水平;对于碳源、氮源,叶绿素含量的降低伴随着较高的叶绿素酶活性水平;对于金属离子,随着叶绿素的降解,叶绿素酶活性也降低。银杏组织培养体系的建立以及外源因子对组培苗叶绿素降解和酶活性的影响:用银杏胚为外植体,以MS、6,7-V培养基为基本培养基,进行组织培养。待子叶展开后定时取样测叶片中的叶绿素含量以及叶绿素酶的酶活性。确定MS培养基为基本培养基,最佳取样时间为第七天。将正常生长的小苗在转入添加有乙烯、6-BA、葡萄糖、6-BA和葡萄糖的组合的培养基中培养,定时取样,测定叶绿素酶活。活体内的叶绿素酶酶活受很多因素的影响,其活性变化体现了诸多因素的动态制衡关系;1200ppm的乙烯利处理能够显著提高叶绿素酶活性。银杏叶叶绿素酶的提取:50g银杏叶加入200ml冷丙酮,匀浆、抽滤制得丙酮粉。从丙酮粉中提取叶绿素酶,提取条件为:20 mmol/L,含0.24%(v/v)TritonX-100的磷酸缓冲液(pH 7.0)。提取最佳时间为1h。对粗酶液进行酶学性质分析,确定银杏叶绿素酶反应体系为底物:缓冲液:酶液=1:9:1。最适反应条件为:温度37℃、pH7.0、底物浓度1.6mmol/L。银杏叶叶绿素酶的分离纯化:粗酶经过有机溶剂沉淀、DEAE-离子交换柱层析、制备型聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化,纯化后的酶蛋白经SDS-PAGE检测为单一条带,分子量为27 kD。以上研究将有助于对落叶树种叶绿素酶的认识,为进一步研究银杏叶绿素酶的反应机制及应用打下基础。