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随着人类文明的发展,对食品、医药的需求和要求也在逐步提高。药用植物作为植物界的一个特殊类群,蕴藏了丰富多样的生物活性物质,为医药、农业提供了原料。川楝,作为一种传统中药,从中提取的川楝素是一种植物源农药,具有重要的价值。 本研究以采集自四川9个地点的川楝根、茎、叶、果为研究材料,选择2种分离培养基,从中分离出了126株内生真菌。对其进行形态学鉴定,其中33株不产孢,没有鉴定,其余93株内生真菌经鉴定属于17个属。 提取所有菌株的DNA,并扩增其ITS片段。以HinfⅠ和HhaⅠ两种限制性内切酶进行ITS-RFLP分析,HinfⅠ得到11种酶切带型,HhaⅠ得到14种酶切带型。用Popgene32软件分析,两种酶的多态位点百分率为99.21%,有效基因数为1.1576,Shannon信息指数为0.1339,基因多样性指数为0.2563。ITS-RFLP的聚类图中,在86%相似水平上聚为37个群,其中有17个菌株单独成群。 从30个ISSR引物中选择清晰度高、重复性好、扩增条带多的2个引物R8和R26用于所有样品的ISSR分析。经ISSR分析发现,126株川楝内生真菌的多态位点百分率为99.61%,有效基因为1.2439,Shannon信息指数为0.3377,基因多样性指数为0.1919。聚类分析后发现,126株内生真菌相似性最低为58%,在100%相似水平上聚为119个群,在86%相似水平上聚为62个群,其中有36个菌株单独成群。 通过形态学鉴定、RFLP和ISSR分析,选取59株多样性明显的菌株扩增其ITS片段,测序后进行BLAST比较和系统发育分析。经形态学和ITS序列分析发现,川楝内生真菌具有非常丰富的资源多样性。210号菌株与相似性最高的Periconiamacrospinosa相似性仅为86%;182号菌株与Botryotinia fuckeliana相似性最高,为100%。川楝内生真菌分属于短梗蠕孢霉属、微壳色单隔孢属、青霉属、交链孢属、脉纹孢菌属、附球霉属、新丛赤壳科属、曲霉属、芽枝霉属、拟茎点霉属、木霉属、茎点霉属、Neofusicoccum属、黑葱花霉属、镰孢霉属、毛霉属、节孢霉属、毛壳菌属、皱赤壳属、多节孢属、肉座菌属、鹿角菌属、葡萄孢盘菌属、枝顶孢霉属和炭垫属25个属,优势属为青霉属和曲霉属。 以测序的59株川楝内生真菌为供试菌株,扩增其NRPS和PKS基因。共得到了6个NRPS基因片段,占扩增总量的10.2%。得到的NRPS片段与GenBank中已知NRPS序列的相似度很高,从99-100%,6个NRPS基因都为青霉属。共得到了12个PKS基因片段,占扩增总量的20.3%。得到的PKS基因均为(I)型的PKS,分属于曲霉属、交链孢属、镰孢霉属、葡萄孢盘菌属,其中有7个为益霉属。 本研究结果表明四川川楝内生真菌生物多样性明显,并从部分菌株中扩增出了NRPS、PKS基因,为寻找和发掘具有价值的菌株和生物活性物质奠定了基础。