CUL4B作为骨架蛋白与DDB1、RBX1以及底物受体蛋白组成Cullin 4B-Ring E3泛素连接酶(Cullin 4B RING E3 ligases, CRL4B)。一方面,CUL4B功能缺失导致细胞增殖、胚胎发育、造血和神经发生等多方面异常；另一方面,CUL4B在包括食管癌、肺癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌及宫颈癌等多种实体肿瘤中表达上调。机制研究发现,CRL4B通过单泛素化H2AK119,协同转录抑制复合物PRC2、SUV39H1/HP1/DNMT3A以及Sin3A/HDAC等,通过调控组蛋白修饰和DNA甲基化,进而调节包括p16、PTEN、p21、IGFBP3、Wnt/β-catenin在内的多条信号通路,促进肿瘤的发生。然而,CUL4B在肺癌中的作用以及肿瘤组织内CUL4B表达上调的机制目前尚不明确。microRNA(miRNA)能够通过与靶mRNA的3’非翻译区(untranslated region, UTR)互补结合,从而抑制靶mRNA翻译。许多抑癌基因和癌基因都是miRNAs的靶基因,其异常表达往往导致肿瘤发生并且影响患者预后。最近的研究表明,miRN A本身也受到表观遗传调控,但是,调控miRNAs表达的机制还有待进一步研究。鉴于CUL4B 和 miRNA在肿瘤的发生发展中扮演着重要的角色,本研究以肺癌细胞为研究对象,研究了CUL4B在肺癌发生中的作用以及CUL4B与miRNAs之间的调控作用。第一部分CUL4 B促进肺癌细胞增殖、迁移和侵袭c UL4B在多种肿瘤中高表达。但是,CUL4B在肺癌发生发展中的作用目前尚不明确。在本部分,我们分析了CUL4B在肺癌中的作用,取得如下结果：1)CUL4B在肺癌组织中表达上调：利用、Western blot分析方法,对收集的30对肺癌及其癌旁组织样本中CUL4B表达水平进行了检测。与前期在其他实体肿瘤组织中得到的结果一致,在66.6%(20/30)的癌组织中CUL4B表达水平明显高于癌旁组织。2)肺癌组织中CUL4B表达受转录后水平调控：为了进一步研究CUL4B在肺癌中表达上调的机制,我们利用q-PCR检测了30对肺癌组织标本中CUL4B mRNA的表达水平,对比分析癌和癌旁组织中CUL4B蛋白和mRNA的表达水平发现,CUL4B蛋白在肿瘤组织中的表达水平变化与其mRNA表达水平表达变化不存在对应关系,表明肺癌组织中CUL4B的表达上调受转录后机制调控。3) CUL4B促进肺癌细胞增殖和肿瘤生长：CUL4B在肺癌组织中表达上调提示其可能发挥癌基因作用。因此我们检测了干扰CUL4B对肺癌细胞系A549增殖的影响。MTT分析显示,干扰CUL4B表达明显抑制A549肺癌细胞增殖；利用裸鼠成瘤模型分析发现干扰CUL4B明显抑制A549细胞株在裸鼠皮下形成的肿瘤生长。4) CUL4B促进肿瘤细胞迁移和侵袭：划痕实验分析表明,低表达CUL4B抑制肿瘤细胞迁移；transwell分析显示,干扰CUL4B表达导致细胞穿过转移小室的能力与对照细胞相比明显下降；transwell基底膜基质胶侵袭实验显示干扰CUL4B导致肿瘤细胞侵袭能力明显减弱。第二部分miR-194调控肺癌细胞CUL4B表达上一部分结果显示CUL4B在肺癌组织中的表达受到转录后水平调控,提示miRNA可能在调控CUL4B表达方面发挥重要作用。为此,本部分我们分析了肺癌细胞中CUL4B表达上调的机制,取得了如下结果：1) miR-194可能作用于CUL4B 3’-UTR:我们利用3个不同的分析软件(TargetScan, miRanda 和 miRDB))对 CUL4B mRNA3’-UTR序列进行了分析,3个软件分析都提示CUL4B可能是miR-194的靶基因；对结合序列分析显示,miR-194在CUL4B 3’UTR上的结合位点在进化上高度保守。这些结果提示CUL4B可能是miR-194的靶基因。2) miR-194直接结合CUL4B mRNA 3’-UTR调控CUL4B蛋白表达：为了确定miR-194对CUL4B调控作用,我们首先通过转染miR-194 mimics和inhibitors检测其对H1299和A549细胞CUL4B蛋白水平的影响。结果发现miR-194 mimics有效降低CUL4B蛋白水平,而niR-194 inhibitors处理能显著增加CUL4B蛋白水平。为明确miR-194是否直接作用于CUL4B mRNA 3’-UTR,我们构建了包含miR-194结合位点的CUL4B 3’-UTR荧光素酶报告载体及该位点突变的载体。我们将野生型载体、突变载体分别与miR-194 mimics、inhibitors以及对照RNA一起转染H1299细胞,检测荧光素酶报告载体的荧光素酶活性。结果表明,与对照RNA相比,niR-194 mimics明显抑制野生型载体的荧光素酶活性,而miR-194 inhibitors则有效上调其荧光素酶活性。然而,miR-194 mimics与miR-194 inhibitors对突变载体的荧光素酶活性则没有类似作用。另外,miRNA pulldown实验证实miR-194 可以直接结合于 CUL4B mRNA的3’-UTR。3) miR-194通过抑制CUL4B蛋白表达影响肺癌细胞迁移：为了确定CUL4B是否是miR-194的下游效应因子,我们利用拯救实验检测了CUL4B 在 miR-194所介导的肺癌细胞迁移能力抑制中的作用。Transwell分析结果表明过表达CUL4B能有效拯救miR-194 mimics对肺癌细胞迁移能力的抑制作用。4) p53-miR-194通路参与调节CUL4B蛋白表达：由于p53可以作为转录因子与miR-194启动子区域直接结合,促进miR-194的转录,因此我们检测了p53对于CUL4B表达的影响。与预期一致,p53缺失的肺癌细胞系H1299中CUL4B蛋白表达水平明显高于p53野生型肺癌细胞系A549。Nutlin-3处理细胞稳定细胞内p53蛋白,p53野生型细胞A549经Nutlin-3处理,细胞内p53蛋白累积的同时CUL4B蛋白减少；但是当Nutlin-3处理缺失p53的H1299细胞时,CUL4B蛋白水平并未发生变化。干扰p53蛋白表达进一步证实其对CUL4B的负调控。为了进一步确定p53调控CUL4B蛋白表达是由miR-194介导,我们用Nutlin-3处理A549细胞,检测了不同的时间点p53、CUL4B和miR-194的表达水平,结果发现CUL4B蛋白水平降低与miR-194的表达的升高具有时间对应性。另外CUL4B 3’-UTR野生型载体荧光素酶的活性在p53缺失的细胞系H1299要高于p53野生型细胞系A549,而H1299细胞miR-194的表达要低于A549细胞。另外,突变载体的荧光素酶活性在两种细胞之间没有明显差别。重要的是,利用miR-194 inhibitors阻断了由于p53升高而引起的内源miR-194的高表达后,荧光素酶活性及CUL4B蛋白减少的趋势得到缓解。这些结果表明p53通过激活miR-194的转录而抑制CUL4B表达。5)miR-194在肺癌样本中低表达并且与CUL4B表达水平呈负相关：我们利用q-PCR检测了肺癌组织标本中miR-194的表达情况,结果发现63.3%(19/30)的肺癌标本中,癌组织miR-194表达水平显著低于癌旁组织。统计分析显示肺癌标本中CUL4B蛋白水平与miR-194表达水平呈负相关。第三部分CUL4B与miR-194在肺癌细胞中形成双重负反馈环为了进一步研究CUL4B促进肿瘤发生发展的分子机制,我们利用高通量miRNA芯片对比分析了低表达CUL4B及对照A549细胞肿瘤相关niRNAs的表达水平,取得了如下结果：1)肺癌细胞中CUL4B在转录水平抑制miR-194的表达：芯片分析结果发现miR-194基因簇(miR-192-194-2和miR-215-194-1)家族成员在CUL4B低表达的细胞中表达升高。通过q-PCR我们在H1299和A549细胞对芯片结果进行了验证,同时发现miR-194基因簇的前体pri-miR-194-1/2在CUL4B低表达的细胞也显著升高,说明CUL4B在转录水平抑制miR-194前体合成。2) CUL4B直接结合在miR-194基因簇启动子区域并抑制miR-194基因簇表达：为了明确CUL4B制miR-194表达的分子机制,我们利用ChIP实验检测CUL4B及其底物H2AK119ub1在miR-192-194-2和miR-215-194-1基因簇启动子区域结合情况,结果显示CUL4B和H2AK119ub1共同结合于miR-192-194-2和miR-215-194-1基因簇启动子TSS上游区域,q-ChIP结果显示在低表达CUL4B的H1299细胞中,CUL4B及其底物H2AK119ub1在iR-192-194-2和miR-215-194-1基因簇的启动子TSS上游区域结合明显减少。与我们前期结果一致EZH2、H3K27me3在这一区域的结合也相应减少,说明CUL4B通过单泛素化H2A招募EZH2进而对H3K27进行甲基化修饰,共同抑制mmiR-192-194-2和miR-215-194-1基因簇的转录。3) CUL4B与miR-194之间形成双重负反馈环：CUL4B可以抑制miR-194表达,同时CUL4B又是miR-194的靶基因,提示二者之间可能形成双重负反馈环。为了验证以上假设,我们将miR-194 mimics转染细胞,结果发现内源的pri-miR-194-1、pri-miR-194-2的表达升高,同时成熟miR-192和miR-215的表达也升高。拯救实验证明转染外源的CUL4B表达载体可以抑制niR-194 mimics导致的pri-miR-194-1、pri-miR-194-2转录激活。这些结果表明CUL4B与 miR-194之间形成相互抑制的双重负反馈环。4) CUL4B通过抑制miR-194进而促进肿瘤进程：因为CUL4B抑制miR-194的表达,因此我们猜测miR-194的靶蛋白在CUL4B低表达的细胞中表达会降低。与预期一致,当干扰CUL4B蛋白表达后细胞内miR-194的靶蛋白RBX1和CDH2的蛋白水平及它们的3’-UTR荧光素酶报告载体活性都显著降低,拯救实验证明CUL4B可以正向调控RBX1和CDH2的蛋白表达。荧光素酶报告载体实验证明CUL4B可以通过miR-194在转录后水平调控RBX1和CDH2的蛋白表达。划痕实验和transwell侵袭实验结果显示转染miR-194 inhibitors能有效缓解由于CUL4B表达而引起的H1299细胞迁移能力的抑制。以上实验结果表明CUL4B对于肺癌发生的影响是部分是通过抑制miR-194实现的。第四部分CUL4B复合物通过抑制miR-371-373基因簇上调CDK2蛋白表达除了miR-194外,miR-371/372/373在CUL4 B表达的A549细胞表达水平也显著升高。因此,本部分我们对CUL4B调节miR-371-373基因簇的机制进行了分析,取得了以下结果：1) CUL4B负调控miR-371-373基因簇家族成员表达：q-PCR结果显示在低表达CUL4B的H1299、A549和HeLa细胞系中,miRNA-371-373基因簇家族成员的表达水平显著升高,而在高表达CUL4B的细胞中,这些miRNAs的表达水平显著降低。2) CUL4B负调控miR-371-373基因簇的转录：我们接着检测了pri-miR-371-373的表达。结果发现,在低表达CUL4B的H1299、A549和HeLa细胞中,pri-miR-371-373表达水平显著升高,而高表达CUL4B则导致pri-miR-371-373的表达水平显著降低。这些结果证明CUL4B在转录水平抑制miR-371-373基因簇的表达。3)CUL4B直接结合在miR-371-373基因簇启动子区域并抑制miR-371-373基因簇表达：ChIP实验结果表明CUL4B及其底物H2AK119ub1可以在miR-371-373基因簇启动子区域直接结合。定量ChIP分析发现,抑制CUL4B表达导致CUL4B、EZH2. H2AK119ub1和H3K27me3#miR-371-373基因簇的启动子区域的结合明显减少。这表明CUL4B通过单泛素化H2A招募EZH2进而对H3K27进行甲基化修饰而抑制miR-371-373基因簇的转录。4)CUL4B通过抑制miR-372/3转录调节CDK2蛋白的表达：miR-372/3可以抑制CDK2的翻译。因此我们对CUL4B-miR-372/3-CDK2调控通路进行了分析。结果发现,抑制CUL4B表达导致CDK2蛋白表达降低。相反,过表达CUL4B导致CDK2蛋白表达上调。转染miR-372/3 inhibitors可以抑制由于CUL4B低表达而引起的CDK2蛋白表达下调。同样荧光素酶实验分析表明低表达CUL4B显著降低野生型CDK23’-UTR荧光素酶报告载体的荧光素酶活性,而对突变载体没有影响。这些结果证明CUL4B通过抑制miR-371-373基因簇的表达上调CDK2。