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目的:沙门菌（Salmonella）是一类感染人与动物的革兰阴性兼性胞内菌,它是食源性细菌感染的常见病原体。沙门菌入侵机体后巨噬细胞可通过自身的抗菌作用和释放趋化因子募集中性粒细胞抵御感染。已证实沙门菌质粒毒力基因spvC在沙门菌感染过程中起重要作用,本研究旨在分析spvC与巨噬细胞焦亡及其释放中性粒细胞趋化因子的关系;研究spvC对中性粒细胞死亡及趋化因子受体的影响;探讨spvC对巨噬细胞和中性粒细胞协同抗菌作用的影响和机制。方法:一、沙门菌质粒毒力基因spvC对巨噬细胞焦亡及其释放中性粒细胞趋化因子的影响应用鼠伤寒沙门菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium,S.typhimurium,STM）野生株SL1344（STM-WT）、spvC基因敲除株STM-△spvC和spvC基因回补株 STM-△spvC/pspvC 按感染复数（Multiplicity of infection,MOI）10:1 分别与小鼠巨噬细胞RAW264.7野生型、gsdmd-/-缺陷型和人单核细胞THP-1分化的巨噬细胞（differentiated THP-1,dTHP-1）建立体外感染模型。1.spvC对巨噬细胞焦亡的影响收集各感染组巨噬细胞培养液,离心取上清,按照乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase,LDH）细胞毒性检测试剂盒说明,动态分析细胞死亡情况;制作不同时间段巨噬细胞爬片,瑞氏-吉姆萨染色,光学显微镜下观察沙门菌感染巨噬细胞的动态过程及其导致的细胞形态变化;提取各巨噬细胞感染组不同时间段的全细胞裂解液,Western Blot检测GSDMD-NT水平。2.spvC对巨噬细胞释放中性粒细胞趋化因子CXCL2和CXCL3的影响收集不同时段各巨噬细胞感染组细胞培养液,离心取上清,按照中性粒细胞趋化因子CXCL2和CXCL3的ELISA检测试剂盒说明,动态检测其水平,分析spvC对沙门菌感染的巨噬细胞释放CXCL2和CXCL3的影响及其与GSDMD的关系。二、沙门菌质粒毒力基因spvC对中性粒细胞死亡及趋化因子受体CXCR2的影响本部分应用STM-WT、STM-△spvC及STM-△spvC/pspvC分别与人早幼粒细胞HL-60分化的中性粒细胞（differentiated HL-60,dHL-60）建立体外感染模型。1.spvC对中性粒细胞死亡的影响受试菌分别以MOI（10:1）和MOI（20:1）与dHL-60共作用,收集不同时段各中性粒细胞感染组细胞培养液,按照LDH细胞毒性检测试剂盒说明,离心取上清进行检测,动态分析细胞死亡情况。根据上述结果,3株受试菌分别以MOI（20:1）与dHL-60共作用,制作不同时段中性粒细胞爬片,瑞氏-吉姆萨染色,光学显微镜下动态观察沙门菌感染中性粒细胞过程及其导致的细胞形态变化;提取各感染组全细胞裂解液,Western Blot动态检测PAD4和Cit-H3的蛋白水平。2.spvC对中性粒细胞趋化因子受体CXCR2蛋白水平的影响受试菌分别以MOI（20:1）与dHL-60共作用,提取各感染组全细胞裂解液,Western Blot动态检测CXCR2的蛋白水平。三、沙门菌质粒毒力基因spvC对巨噬细胞和中性粒细胞相互作用的影响1.spvC对中性粒细胞释放IL-1β的影响STM-WT、STM-△spvC及STM-△spvC/pspvC 以 MOI（20:1）与 dHL-60 共作用,收集各感染组中性粒细胞培养液,离心取上清,按照IL-1β的ELISA检测试剂盒说明,动态检测IL-1β水平并分析比对。2.spvC对中性粒细胞募集效应的影响上述3株受试菌以MOI（10:1）与巨噬细胞dTHP-1共作用,收集感染4 h、12 h和24 h的细胞培养液于Transwell下室,上室放入dHL-60,共培养3 h,流式细胞术计数募集至下室的中性粒细胞数。结果:1.spvC对沙门菌感染的巨噬细胞焦亡的影响spvC对巨噬细胞死亡率的影响:各感染组感染4 h的LDH释放量无明显差异,各组LDH释放水平均随着感染时间延长而升高;感染12 h和24 h,STM-△spvC感染的各组巨噬细胞LDH释放量均高于野生株和回补株感染组;感染24 h,野生型RAW264.7的LDH释放水平明显高于gsdmd-/-缺陷型感染组。spvC对巨噬细胞形态的影响:各感染组感染4 h细胞形态较为完好,细胞内外细菌数较少,各组未见明显差异。随着感染时间延长,各感染组细胞形态完整性受到破坏,细胞内外细菌数增多;感染24h,STM-△spvC感染的各组巨噬细胞形态破坏更明显,细胞内外细菌数更多,且野生型RAW264.7相比于gsdm-/-缺陷型RAW264.7的STM-△spvC感染组细胞破坏更严重,但细胞内外细菌数明显减少。spvC对巨噬细胞GSDMD-NT蛋白水平的影响:各感染组感染4h细胞GSDMD-NT含量无明显差异,随着感染时间延长,各感染组细胞中GSDMD-NT的含量均增多;感染12 h和24 h,STM-△spvC感染的野生型RAW264.7的GSDMD-NT水平高于野生株和回补株感染组。感染24h,STM-△spvC感染的dTHP-1细胞GSDMD-NT水平明显增高。2.spvC对巨噬细胞释放中性粒细胞趋化因子CXCL2和CXCL3的影响感染4 h、12 h和24 h,STM-AspvC感染的各组巨噬细胞CXCL2和CXCL3释放总量均高于野生株和回补株感染组。各时间段野生型RAW264.7比gsdmd-/-缺陷型RAW264.7的CXCL2释放总量均更低;感染4 h,野生型RAW264.7比gsdmd-/-缺陷型RAW264.7的CXCL3释放总量更高,感染24 h后CXCL3释放总量更低。随着感染时间延长,野生型RAW264.7和gsdmd-/-缺陷型RAW264.7的CXCL2和CXCL3趋化因子水平均升高。3.spvC对沙门菌感染的中性粒细胞死亡的影响不同感染复数下spvC对中性粒细胞死亡率的影响:沙门菌以MOI（10:1）感染dHL-60时,感染4h、12 h和24 h,各感染组LDH含量无明显差异;以MOI（20:1）感染时,STM-△spvC感染组在感染24 h LDH释放水平更高。随着感染时间延长,MOI（10:1）和MOI（20:1）感染组LDH释放水平均升高。spvC对中性粒细胞形态的影响:感染1h和2h,dHL-60各感染组细胞形态较为完整,存在大量胞内菌,细胞核呈圆形,随着感染时间延长,各感染组细胞完整性破坏严重;感染4 h,各感染组细胞完整性出现破坏,细胞内外细菌数增多,部分细胞核消失;感染12 h,STM-△spvC感染的dHL-60细胞完整性比野生株和回补株感染组破坏更加严重,细胞内细菌减少;感染24 h,各感染组细胞大量死亡,细胞核消失。spvC对中性粒细胞的PAD4和Cit-H3含量的影响:STM-△spvC感染dHL-60的PAD4和Cit-H3蛋白水平在感染1h更低;感染2h和4h差异消失;感染12 h和24 h则明显升高。4.spvC对中性粒细胞趋化因子受体CXCR2蛋白水平的影响STM-△spvC感染组的CXCR2蛋白水平在感染1h和2 h无明显差异,感染4 h、12 h和24 h均高于野生株和回补株感染组。5.spvC对巨噬细胞和中性粒细胞相互作用的影响spvC对中性粒细胞释放IL-1β的影响:感染1h、2h、4h、12 h和24 h,STM-△spvC感染组的IL-1β释放水平均明显高于野生株和回补株感染组;各感染组随着感染时间的延长,IL-1β的释放水平均增高。spvC对中性粒细胞募集效应的影响:Transwell下室加入感染各组细菌4 h的dTHP-1培养液上清,dHL-60的募集未见明显差异。随着感染时间的延长,各实验组募集的dHL-60数均增加;加入感染各组细菌12 h和24 h的dTHP-1培养液上清后,发现STM-△spvC感染的dTHP-1上清可募集比野生株和回补株感染组更多的dHL-60,差异有统计学意义。结论:1.沙门菌质粒毒力基因spvC抑制巨噬细胞焦亡,下调巨噬细胞释放的中性粒细胞趋化因子CXCL2和CXCL3含量。2.沙门菌质粒毒力基因spvC对中性粒细胞死亡的影响与感染的细菌数量密切相关,高感染复数时可抑制中性粒细胞死亡,降低NETosis相关蛋白PAD4和Cit-H3含量,推测可抑制NETosis的发生抵抗中性粒细胞抗菌功能。3.沙门菌质粒毒力基因spvC下调中性粒细胞趋化因子受体CXCR2的水平并抑制IL-1β的释放,抵抗中性粒细胞的募集及其与巨噬细胞的协同抗菌作用。