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实验目的疟疾感染是当今威胁人类健康的主要难题之一,每年有一百多万儿童死于疟疾。脑型疟疾(cerebral malaria, CM),简称脑疟,是疟疾最严重的并发症之一,而且是疟疾感染的主要死因。CM严重性的决定因素尚不完全清楚,但很可能来自宿主和寄生虫两方面。最终,寄生虫和免疫应答的相互作用决定宿主感染结局。因此,关于CM发生免疫机制的基础研究是研制有效抗疟疫苗和药物的前提。伯氏疟原虫(Plasmodium berghei ANKA,P.bANKA)鼠疟与人类疾病有许多共同特征,是现有CM的最佳模型。目前研究认为CM是由脑血管内感染红细胞(parasitized red blood cells,pRBC)粘附和细胞因子及效应细胞介导的强烈的宿主前炎症应答的结合效应引起的疾病。相关研究表明活化T细胞介导的免疫应答参与疾病诱导,并且CD4+T细胞和CD8+T细胞均可促进脑病变发生。事实上,Thl应答在控制虫血症方面发挥关键作用,同时也促进CM发生。CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cells, Tregs)是不同于Thl和Th2的具有免疫调节效应的T细胞亚群。Tregs活化是寄生虫逃避宿主免疫的机制之一前期试验已证明Tregs活化与约氏疟原虫(Plasmodium yoelii 17XL, P.yoelii 17XL)感染鼠的易感性相关,Tregs可通过修饰树突状细胞(Dendritic cells, DCs)应答,诱导IL-10产生和CD4+T细胞凋亡调控Th1应答。为此本研究动态观察了正常感染鼠及Tregs消除鼠前炎性细胞因子,抗炎性细胞因子表达水平和Tregs增殖变化,以期阐明Tregs在脑疟发生中的作用地位及其相关机制。实验方法1、实验动物模型构建及CM病变评估6-8w,雌性C57BL/6经腹腔感染1×106 P.berghei ANKA寄生的红细胞(pRBC)构建CM易感模型,感染BALB/c和DBA/2鼠构建CM抵抗模型。实验组(6只/组)和对照组(6只/组)小鼠于感染前1d和感染后1d分别经腹腔注射1mganti-CD25mAb (7D4,rat IgM; Bio Express)和等体积phosphate-buffered saline (PBS)构建Tregs消除小鼠模型。感染后6天起每日监测鼠两次,评价临床实验脑疟(Experimental cerebral malaria, ECM)症状,用以下症状确定ECM得分：皮毛竖起、颤抖、肢体瘫痪、痉挛、昏迷。每出现一个症状给予1分,累计得分≥4分者考虑为重型疟疾。2、流式细胞术检测脾细胞悬液中CD4+T细胞群内CD4+CD25+Foxp3+Tregs的百分含量分别于感染前和感染后第3d、5d、8d常规无菌取出小鼠脾脏,用0.17mol/LNH4C1裂解红细胞,以含10%胎牛血清(Fetal calf serum, FCS)的RPMI1640调整脾细胞终浓度为1×107/ml。每份样品用FITC-conjugated anti-mouse CD4/L3T4 (GK1.5; BD Pharmingen), APC-conjugated anti-mouse CD25/IL-2 receptor alpha (PC61; BD Pharmingen)和PE-conjugated anti-Foxp3 (clone FJK16s; eBioscience)进行三色分析,另设阴性对照管。在流式细胞仪专用染色管中加入新鲜制备的1×107/ml脾细胞悬液0.1ml,并用FcγⅢ/Ⅱ封闭抗体孵育以阻断荧光抗体的非特异染色,再加入抗CD4-FITC和抗CD25-APC mAb进行表面染色,固定透膜后,用抗Foxp3-PE mAb进行胞浆内染色,用含1%FCS的PBS洗涤两次并悬浮于500μlPBS中,流式细胞仪(Becton Dickinson, USA)进行检测。以前向和侧向散射角确定淋巴细胞群,CD4+T细胞画门,分析计算CD4+T细胞群内CD4+CD25+Foxp3+Tregs的百分率。3、采用双抗体夹心ELISA法检测脾细胞培养上清IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-17、IL-10及Griess方法检测NO2-含量(1)脾细胞样品制备分别于感染前和感染后第3d，5d，8d常规无菌取出小鼠脾脏,用0.17mol/L NH4Cl裂解红细胞。以含10%FCS的RPMI1640调整脾细胞终浓度为1×107/ml，于24孔培养板中,每孔加入500μl脾细胞悬液于37℃,5%CO2条件下培养48h。需要注意的是天然脾细胞与纯化NA/LE hamster anti-mouse CD3e (145-2C11, BD Pharmingen,0.56μl/well)和纯化NA/LE hamster anti-mouse CD28 (37.51, BD Pharmingen,0.112μl/well)于37℃,5%CO2条件下共同培养48h以刺激IL-17产生,随后收集培养上清,-80℃保存,待细胞因子及NO检测。(2)双抗体夹心ELISA试剂盒分别检测脾细胞培养上清中IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-10、IL-17的分泌水平,酶标仪测定450nm处OD值。结果以试剂盒提供的标准品绘制标准曲线,应用SoftMax Pro 4.3.1Ls软件分析,计算细胞因子含量(pg/ml)。(3) Griess方法检测脾细胞培养上清中NO2-含量100μl上清和Griess反应液100μl室温反应10min,用NaNO2作为标准品,酶标仪检测550nm处OD值。实验结果1、感染率、幸存率与疾病评估脑疟是通过给C57BL/6小鼠注射毒性P.bANKA血液阶段寄生虫诱导的,C57BL/6小鼠于感染后8-11天死于麻痹和昏迷,虫血症为10-20%。相比而言,抵抗型BALB/c和DBA/2小鼠经历类似的寄生虫生长但不发生脑病变,于感染后3-4w死于贫血和过度虫血症(>60%)。从脑疟症状的临床得分来看,C57BL/6小鼠得分高于BALB/c和DBA/2小鼠。2、易感和抵抗小鼠感染期间脾细胞培养上清前炎性细胞因子、抗炎性细胞因子和NO水平的动态检测CM易感C57BL/6鼠和抵抗BALB/c与DBA/2鼠脾细胞培养上清前炎性细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-17及NO于感染后开始升高,感染后5天达峰值,感染后8天下降(C57BL/6鼠呈现轻微下降)。三种鼠脾细胞培养上清抗炎性细胞因子IL-10也于感染后5天达峰值,在感染后8天C57BL/6鼠IL-10水平显著下降,抵抗BALB/c与DBA/2鼠IL-10水平轻微下降。易感鼠脾细胞培养上清前炎性细胞因子和NO水平显著高于抵抗鼠,而IL-10水平显著低于抵抗鼠。3、易感和抵抗小鼠感染后不同时间点脾CD4+T细胞中Tregs的百分比和绝对数CM易感鼠和抵抗鼠脾脏CD4+T细胞中Tregs百分比和绝对数于感染后开始升高,感染后3天达峰值,感染后5天到8天逐渐下降。并且在感染期间,C57BL/6鼠脾脏CD4+T细胞中Tregs百分比和绝对数显著低于BALB/c和DBA/2小鼠。4、体内CD25消除后Tregs效应分析CD25消除的C57BL/6、BALB/c和DBA/2小鼠脾脏CD4+T细胞中Tregs百分数显著低于相应对照鼠。与正常感染鼠相比,Tregs消除的C57BL/6鼠幸存率明显增加,感染后5、6、7天感染率显著下降,CM症状的临床得分也相应减少,CD25消除的C57BL/6鼠不发生脑疟症状,于感染后3-4周死于贫血和过度虫血症。CD25消除的BALB/c和DBA/2鼠与正常感染鼠感染过程相似,但在感染初期虫血症得到暂时控制,CD25消除后8天Tregs’快速恢复,抑制T细胞活化,不能控制虫血症,这些鼠于感染后3-4周死于过度虫血症和严重贫血。CD25消除明显逆转IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-17、IL-10及NO产生。CD25消除的DBA/2小鼠与CD25消除的BALB/c小鼠的感染进程和细胞因子产生过程相似。5、易感和抵抗鼠感染后不同时间Tregs与IFN-γ、TNF-α、NO及IL-10与虫血症的相关性分析脑疟易感鼠和抵抗鼠感染期间Tregs数量与IFN-γ、TNF-α、NO产生呈负相关,IL-10产生与虫体血症水平正相关。结论1、前炎症应答和抗炎症应答之间平衡的设立对控制重型疟疾发生至关重要,Tregs是维持此平衡的重要调节因子。2、Tregs通过修饰前炎症应答从而调控前炎症应答与抗炎症应答之间的平衡以介导CM的发生和感染结局。