论文部分内容阅读
本文从以下四部分进行阐述
第一章
目的：
采用532nm倍频激光建立实验性脉络膜新生血管(ChoroidalNeovascularization，CNV)动物模型，为CNV的相关基础研究提供模型参考。
方法：
1.应用532nm倍频激光光凝棕色挪威(Brown Norway, BN)大鼠建立实验性CNV模型，分别在光凝后1d、3d、Sd、7d、14d、21d采用眼底照、眼底荧光血管造影(Fundus Fluorescein Angiograph，FFA)和吲哚菁绿血管造影(Indocyanine green Angiography，ICGA)观察光凝后不同时间点CNV的变化情况。
2.制作BN大鼠CNV眼组织病理学标本，采用HE染色法观察光凝后不同时间点CNV中央厚度。
3.制作BN大鼠CNV眼组织病理学标本，采用免疫组织化学染色法观察光凝后不同时间点CNV眼组织中CD105因子表达的情况。
结果：
1.光凝后1d光斑处无荧光素渗漏;光凝后3d、5d仅有少量光斑处有荧光素渗漏。光凝后7dCNV生成率为70.18％，荧光素渗漏平均光密度值为128.30士11.21。光凝后14dCNV生成率为78.18％，平均光密度值为182.12士6.59，与光凝后7d组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。光凝后21d，CNV生成率和荧光素渗漏平均光密度值与光凝后14d组比较差异无统计学意义。
2.HE染色结果显示:随着光凝后时间的增加，CNV中央厚度逐渐增加，光凝后7dCNV厚度为48.92士2.81μm，较光凝后1d显著增加（P＜0.05）;光凝后14dCNV厚度为61.98士5.06μm，较光凝后7d显著增加(P＜0.05);光凝后21dCNV厚度为61.78士4.03μm，与14d组比较差异无统计学意义。
3.CD105免疫组化结果显示:
结论：
1.应用532nm激光光凝可以成功建立BN大鼠实验性CNV动物模型。
2.CNV在光凝后7d至14d生长迅速，至21d逐渐稳定，此模型具有成模速度快，成模率高、重复性好、成本低的优点，可作为CNV基础研究的动物模型。
3.眼底照、FFA、ICGA、HE染色和免疫组化检查可以动态观察CN-V的变化。
第二章
目的：
观察中药单体姜黄素对BN大鼠实验性CNV的抑制作用，以及对AKT/p-AKT/HIF-1α/VEGF信号通路活性的影响，为姜黄素治疗CNV提供实验依据。
方法：
1.应用532nm倍频激光光凝诱导BN大鼠建立CNV模型，造模后的大鼠被随机分为正常组、模型组、雷珠单抗组、姜黄素低剂量组、姜黄素中剂量组和姜黄素高剂量组，在光凝后14d进行眼底照、FFA与ICGA检查。
2.制作BN大鼠CNV眼组织病理学标本，采用HE染色法观察不同组CNV中央厚度。
3.制作BN大鼠CNV眼组织病理学标本，采用免疫组织化学法观察不同组CNV眼组织中AKT/p-AKT/HIF-1α/VEGF信号通路各因子蛋白的表达情况。
4.采用RT-qPCR法检测CNV眼组织中AKT/HIF-1α/VEGF信号通路各因子mRNA的相对表达量。
5.采用蛋白免疫印迹(Westernblot)法检测CNV眼组织中AKT/p-AKT/HIF-1α/VEGF信号通路各因子蛋白的相对表达量。
结果：
1.正常组未打激光，模型组，雷珠单抗组，姜黄素低、中、高剂量组CNV生成率分别为78.18％、73.21％、77.19％、75.86％、74.55％，组间比较差异无统计学意义;荧光素渗漏平均光密度值分别为182.12士6.59、119.22士8.03、166.45士8.33、164.34士5.69、149.22士6.45;雷珠单抗组较模型组显著降低(P＜0.05);姜黄素低、中、高剂量组较雷珠单抗组显著升高（P＜0.05），其中姜黄素高剂量组较模型组显著降低（P＜0.05）。
2.HE染色结果显示:正常组BN大鼠视网膜组织各层结构清晰、排列整齐。
3.免疫组化结果显示:正常组BN大鼠视网膜组织结构中AKT、p-AKT、HIF-1α、VEGF因子表达呈阴性，未见棕黄色反应物。
4.mRNA结果显示:
5.Westernblot结果显示:光凝后14d，AKT蛋白各组间比较差异无统计学意义。
结论：
1.高剂量姜黄素(400mg/Kg/d)对激光诱导的BN大鼠实验性CNV的形成具有抑制作用。
2.姜黄素抑制BN大鼠实验性CNV的机制可能与抑制AKT/p-AKT/HIF-1α/VEGF信号通路的激活，降低相关因子的表达有关。
第三章
目的：
观察姜黄素对氯化钴(CoCl2)诱导的人视网膜色素上皮细胞株-19(adultretinal pigment epithelial cell line-19，ARPE-19)细胞缺氧模型中AKT、HIF-1α和VEGF因子mRNA及蛋白表达的影响。
方法：
1.采用CoCl2诱导ARPE-19细胞建立化学性缺氧模型，应用CCK-8法筛选造模试剂CoCl2、实验药物姜黄素和阳性对照药雷珠单抗的浓度，同时检测姜黄素对CoCl2诱导的ARPE-19细胞活性的影响。
2.将ARPE-19细胞分为正常组、模型组、雷珠单抗组、姜黄素低、中、高剂量组，应用RT-qPCR法检测姜黄素对CoCl2诱导的ARPE-19细胞缺氧模型AKT、HIF-1α和VEGF mRNA表达量的影响。
3.将ARPE-19细胞分为正常组、模型组、雷珠单抗组、姜黄素低、中、高剂量组，应用Westernblot法检测姜黄素对CoCl2诱导的ARPE-19细胞缺氧模型AKT、p-AKT、HIF-1α和VEGF蛋白表达量的影响。
结果：
1.CCK-8细胞活性检测:随着CoCl2浓度的增加，ARPE-19细胞活性呈现先增长后抑制，当CoCl2终浓度≧200μM时，细胞活性显著降低(P＜0.05)。
2.RT-qPCR结果显示:模型组AKT、HIF-1α和VEGF mRNA相对表达量均高于正常组(P＜0.05);雷珠单抗组均低于模型组(P＜0.05);姜黄素低、中剂量组与模型组比较差异无统计学意义(P＜0.05);姜黄素高剂量组较模型组显著降低(P＜0.05);与雷珠单抗组比较差异无统计学意义。
3.Westernblot结果显示:AKT蛋白相对表达量各组间比较差异无统计学意义。
结论：
1.应用CoCl2可成功建立APRE-19细胞化学缺氧模型。
2.CoCl2在终浓度为100μM时可增加细胞中AKT、HIF-1α和VEGF mRNA及p-AKT、HIF-1α和VEGF蛋白的表达量。
3.高剂量姜黄素(100μM)可降低CoCl2诱导的ARPE-19细胞中AKT、HIF-1α和VEGF mRNA及p-AKT、HIF-1α和VEGF蛋白的表达。
4.姜黄素(100μM)对CoCl2诱导ARPE-19细胞缺氧具有保护作用。
第四章
目的：
观察ARPE-19细胞的各组条件培养液对人脐静脉内皮细胞(humanumbilicalvein endothelial cells，HUVEC)细胞增殖、迁移、侵袭和管腔形成的影响。
方法：
1.将ARPE-19细胞条件培养液分为正常组、模型组、雷珠单抗组、姜黄素低、中、高剂量组，分别作用于HUVEC细胞;采用CCK-8法观察ARPE-19细胞的各组条件培养液对HUVEC细胞活性的影响。
2.采用细胞划痕实验观察在非接触情况下ARPE-19细胞的各组条件培养液对HUVEC细胞的水平迁移的影响。
3.采用Transwell小室迁移实验观察在非接触情况下ARPE-19细胞的各组条件培养液对HUVEC细胞的垂直迁移的影响。
4.采用Transwell小室侵袭实验观察在非接触情况下ARPE-19细胞的各组条件培养液对HUVEC细胞的侵袭的影响。
5.采用Matrigel基质胶管腔形成实验，观察在非接触情况下ARPE-19细胞的各组条件培养液对HUVEC细胞管腔形成的影响。
结果：
1.ARPE-19细胞的各组条件培养液对HUVEC细胞活性的影响，组间差异无统计学意义。
2.HUVEC细胞水平迁移实验结果显示:
3.HUVEC细胞垂直迁移实验结果显示:
4.HUVEC细胞侵袭实验结果显示:
5.HUVEC细胞管腔形成实验结果显示:
结论：
1.ARPE-19细胞姜黄素低（6.25μM）、中(25μM)、高剂量组(100μM)条件培养液可显著抑制HUVEC细胞水平迁移;其中高剂量组条件培养液可显著抑制HUVEC细胞垂直迁移。
2.ARPE-19细胞姜黄素高剂量组(100μM)条件培养液可抑制HUVEC细胞侵袭。
3.ARPE-19细胞姜黄素中（25μM）、高剂量组(100μM)条件培养液可抑制HUVEC细胞管腔形成。
4.姜黄素可在细胞水平抑制血管的生成。
第一章
目的：
采用532nm倍频激光建立实验性脉络膜新生血管(ChoroidalNeovascularization，CNV)动物模型，为CNV的相关基础研究提供模型参考。
方法：
1.应用532nm倍频激光光凝棕色挪威(Brown Norway, BN)大鼠建立实验性CNV模型，分别在光凝后1d、3d、Sd、7d、14d、21d采用眼底照、眼底荧光血管造影(Fundus Fluorescein Angiograph，FFA)和吲哚菁绿血管造影(Indocyanine green Angiography，ICGA)观察光凝后不同时间点CNV的变化情况。
2.制作BN大鼠CNV眼组织病理学标本，采用HE染色法观察光凝后不同时间点CNV中央厚度。
3.制作BN大鼠CNV眼组织病理学标本，采用免疫组织化学染色法观察光凝后不同时间点CNV眼组织中CD105因子表达的情况。
结果：
1.光凝后1d光斑处无荧光素渗漏;光凝后3d、5d仅有少量光斑处有荧光素渗漏。光凝后7dCNV生成率为70.18％，荧光素渗漏平均光密度值为128.30士11.21。光凝后14dCNV生成率为78.18％，平均光密度值为182.12士6.59，与光凝后7d组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。光凝后21d，CNV生成率和荧光素渗漏平均光密度值与光凝后14d组比较差异无统计学意义。
2.HE染色结果显示:随着光凝后时间的增加，CNV中央厚度逐渐增加，光凝后7dCNV厚度为48.92士2.81μm，较光凝后1d显著增加（P＜0.05）;光凝后14dCNV厚度为61.98士5.06μm，较光凝后7d显著增加(P＜0.05);光凝后21dCNV厚度为61.78士4.03μm，与14d组比较差异无统计学意义。
3.CD105免疫组化结果显示:
结论：
1.应用532nm激光光凝可以成功建立BN大鼠实验性CNV动物模型。
2.CNV在光凝后7d至14d生长迅速，至21d逐渐稳定，此模型具有成模速度快，成模率高、重复性好、成本低的优点，可作为CNV基础研究的动物模型。
3.眼底照、FFA、ICGA、HE染色和免疫组化检查可以动态观察CN-V的变化。
第二章
目的：
观察中药单体姜黄素对BN大鼠实验性CNV的抑制作用，以及对AKT/p-AKT/HIF-1α/VEGF信号通路活性的影响，为姜黄素治疗CNV提供实验依据。
方法：
1.应用532nm倍频激光光凝诱导BN大鼠建立CNV模型，造模后的大鼠被随机分为正常组、模型组、雷珠单抗组、姜黄素低剂量组、姜黄素中剂量组和姜黄素高剂量组，在光凝后14d进行眼底照、FFA与ICGA检查。
2.制作BN大鼠CNV眼组织病理学标本，采用HE染色法观察不同组CNV中央厚度。
3.制作BN大鼠CNV眼组织病理学标本，采用免疫组织化学法观察不同组CNV眼组织中AKT/p-AKT/HIF-1α/VEGF信号通路各因子蛋白的表达情况。
4.采用RT-qPCR法检测CNV眼组织中AKT/HIF-1α/VEGF信号通路各因子mRNA的相对表达量。
5.采用蛋白免疫印迹(Westernblot)法检测CNV眼组织中AKT/p-AKT/HIF-1α/VEGF信号通路各因子蛋白的相对表达量。
结果：
1.正常组未打激光，模型组，雷珠单抗组，姜黄素低、中、高剂量组CNV生成率分别为78.18％、73.21％、77.19％、75.86％、74.55％，组间比较差异无统计学意义;荧光素渗漏平均光密度值分别为182.12士6.59、119.22士8.03、166.45士8.33、164.34士5.69、149.22士6.45;雷珠单抗组较模型组显著降低(P＜0.05);姜黄素低、中、高剂量组较雷珠单抗组显著升高（P＜0.05），其中姜黄素高剂量组较模型组显著降低（P＜0.05）。
2.HE染色结果显示:正常组BN大鼠视网膜组织各层结构清晰、排列整齐。
3.免疫组化结果显示:正常组BN大鼠视网膜组织结构中AKT、p-AKT、HIF-1α、VEGF因子表达呈阴性，未见棕黄色反应物。
4.mRNA结果显示:
5.Westernblot结果显示:光凝后14d，AKT蛋白各组间比较差异无统计学意义。
结论：
1.高剂量姜黄素(400mg/Kg/d)对激光诱导的BN大鼠实验性CNV的形成具有抑制作用。
2.姜黄素抑制BN大鼠实验性CNV的机制可能与抑制AKT/p-AKT/HIF-1α/VEGF信号通路的激活，降低相关因子的表达有关。
第三章
目的：
观察姜黄素对氯化钴(CoCl2)诱导的人视网膜色素上皮细胞株-19(adultretinal pigment epithelial cell line-19，ARPE-19)细胞缺氧模型中AKT、HIF-1α和VEGF因子mRNA及蛋白表达的影响。
方法：
1.采用CoCl2诱导ARPE-19细胞建立化学性缺氧模型，应用CCK-8法筛选造模试剂CoCl2、实验药物姜黄素和阳性对照药雷珠单抗的浓度，同时检测姜黄素对CoCl2诱导的ARPE-19细胞活性的影响。
2.将ARPE-19细胞分为正常组、模型组、雷珠单抗组、姜黄素低、中、高剂量组，应用RT-qPCR法检测姜黄素对CoCl2诱导的ARPE-19细胞缺氧模型AKT、HIF-1α和VEGF mRNA表达量的影响。
3.将ARPE-19细胞分为正常组、模型组、雷珠单抗组、姜黄素低、中、高剂量组，应用Westernblot法检测姜黄素对CoCl2诱导的ARPE-19细胞缺氧模型AKT、p-AKT、HIF-1α和VEGF蛋白表达量的影响。
结果：
1.CCK-8细胞活性检测:随着CoCl2浓度的增加，ARPE-19细胞活性呈现先增长后抑制，当CoCl2终浓度≧200μM时，细胞活性显著降低(P＜0.05)。
2.RT-qPCR结果显示:模型组AKT、HIF-1α和VEGF mRNA相对表达量均高于正常组(P＜0.05);雷珠单抗组均低于模型组(P＜0.05);姜黄素低、中剂量组与模型组比较差异无统计学意义(P＜0.05);姜黄素高剂量组较模型组显著降低(P＜0.05);与雷珠单抗组比较差异无统计学意义。
3.Westernblot结果显示:AKT蛋白相对表达量各组间比较差异无统计学意义。
结论：
1.应用CoCl2可成功建立APRE-19细胞化学缺氧模型。
2.CoCl2在终浓度为100μM时可增加细胞中AKT、HIF-1α和VEGF mRNA及p-AKT、HIF-1α和VEGF蛋白的表达量。
3.高剂量姜黄素(100μM)可降低CoCl2诱导的ARPE-19细胞中AKT、HIF-1α和VEGF mRNA及p-AKT、HIF-1α和VEGF蛋白的表达。
4.姜黄素(100μM)对CoCl2诱导ARPE-19细胞缺氧具有保护作用。
第四章
目的：
观察ARPE-19细胞的各组条件培养液对人脐静脉内皮细胞(humanumbilicalvein endothelial cells，HUVEC)细胞增殖、迁移、侵袭和管腔形成的影响。
方法：
1.将ARPE-19细胞条件培养液分为正常组、模型组、雷珠单抗组、姜黄素低、中、高剂量组，分别作用于HUVEC细胞;采用CCK-8法观察ARPE-19细胞的各组条件培养液对HUVEC细胞活性的影响。
2.采用细胞划痕实验观察在非接触情况下ARPE-19细胞的各组条件培养液对HUVEC细胞的水平迁移的影响。
3.采用Transwell小室迁移实验观察在非接触情况下ARPE-19细胞的各组条件培养液对HUVEC细胞的垂直迁移的影响。
4.采用Transwell小室侵袭实验观察在非接触情况下ARPE-19细胞的各组条件培养液对HUVEC细胞的侵袭的影响。
5.采用Matrigel基质胶管腔形成实验，观察在非接触情况下ARPE-19细胞的各组条件培养液对HUVEC细胞管腔形成的影响。
结果：
1.ARPE-19细胞的各组条件培养液对HUVEC细胞活性的影响，组间差异无统计学意义。
2.HUVEC细胞水平迁移实验结果显示:
3.HUVEC细胞垂直迁移实验结果显示:
4.HUVEC细胞侵袭实验结果显示:
5.HUVEC细胞管腔形成实验结果显示:
结论：
1.ARPE-19细胞姜黄素低（6.25μM）、中(25μM)、高剂量组(100μM)条件培养液可显著抑制HUVEC细胞水平迁移;其中高剂量组条件培养液可显著抑制HUVEC细胞垂直迁移。
2.ARPE-19细胞姜黄素高剂量组(100μM)条件培养液可抑制HUVEC细胞侵袭。
3.ARPE-19细胞姜黄素中（25μM）、高剂量组(100μM)条件培养液可抑制HUVEC细胞管腔形成。
4.姜黄素可在细胞水平抑制血管的生成。