背景与目的:结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）,或称大肠癌,主要包括结肠癌和直肠癌,是世界上最常见的消化道癌症之一。最新的全球癌症流行病学数据表明,在全球肿瘤发病率与死亡率排名中,结直肠癌分别位于第四位及第二位,并且该癌症的患病率呈现逐年递增的趋势,仅在2018年全球就有180.1万新增病例。炎症性肠病（inflammatory bowel disease,IBD）是一种病因不明的慢性、复发率高的消化道自身免疫性疾病,包括溃疡性结肠炎（ulcerative colitis,UC）和克罗恩病（Crohn’s disease,CD）两种主要形式,被认为是大肠癌重要的癌前疾病,疾病持续时间越长,癌变的风险越高。据报道,UC患者疾病持续时间10年发生与IBD相关的CRC累积风险率为2%,20年累积风险率为8%,30年累积风险率为18%。慢性炎症是免疫细胞浸润和增殖的主要原因,并且被认为是与结肠炎相关结直肠癌（colitis-associated colorectal cancer）相关的高危因素。研究证实IBD存在“炎症-不典型增生-癌症”序列演进规律,但IBD的癌变机制尚不清楚,临床上也缺乏有效的监测和预防手段。因此,阐明结直肠炎-癌的发病机制,制定有效的结直肠癌防治措施至关重要。Toll样受体9（toll-like receptor 9,TLR9）是Toll样受体（toll-like receptors,TLRs）家族的成员,位于细胞浆和细胞内的内体中,可以被未甲基化的细菌Cp G DNA激活。TLR9信号通路的激活诱导1型辅助T细胞（Th1）免疫应答并刺激B淋巴细胞的增殖,从而保护宿主免受外部微生物的侵袭。多项研究表明,异常的TLR9表达可能参与UC的发病和发展。同时,这种异常表达也存在于结直肠癌的发生和发展过程中。TLR9参与IBD和CRC的发生发展的具体机制及是否参与IBD“炎症-不典型增生-癌症”这一进程目前尚不清楚。核转录因子NF-κB参与多种生物进程,包括炎症反应,免疫反应,细胞凋亡和增殖,被认为是连接炎症和癌症的分子中心。研究表明,NF-κB可能通过调节金属基质蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9,MMP-9）在结直肠癌发生中起重要作用。众多基因参与调控NF-κB信号通路的活性,包括腺苷酸活化蛋白激酶（adenylate-activated protein kinase,AMPK）、TLRs和肿瘤坏死因子受体等。研究已报道TLR9依赖My D88/NF-κB信号调节IL-6的表达。但在结直肠癌的肿瘤进程中TLR9是否调控NF-κB及相关机制尚未阐明。因此,本课题拟通过体内外实验系统探讨TLR9在结直肠炎-结直肠癌发生发展中的作用,及其与NF-κB的关系,为结直肠癌的发病机制提供新的理论依据,以期为结直肠癌尤其是结肠炎相关性结直肠癌提供早期检测方案或治疗性分子靶点。第一部分:TLR9在IBD及人结直肠癌组织中的表达目的:探讨TLR9在IBD及人结直肠癌中的表达及临床意义。方法:收集IBD患者（25例）的结直肠组织病变及病变旁标本,用免疫组化方法检测TLR9在IBD病变及病变旁的表达;收集不同病理分期的结直肠癌及癌旁组织标本（49对）,用免疫组化方法检测TLR9在结直肠癌及癌旁的表达,并分析TLR9与结直肠癌临床病理参数的关系。结果:1、TLR9在IBD患者的病变及病变旁的表达没有明显统计学差异（P>0.05）,而TLR9在71.4%（35/49）的结直肠癌组织中的表达明显高于相应的癌旁组织（P<0.05）;2、TLR9蛋白表达与结直肠癌患者的年龄、性别、发病部位及肿瘤分化程度均无明显相关（P>0.05）;3、TLR9的蛋白表达与肿瘤淋巴结转移相关,其中有淋巴结转移的结直肠癌中TLR9的表达量明显高于无淋巴结转移组（P<0.05）;4、TLR9的蛋白表达与结直肠癌TNM分期相关,其中晚期（III～IV期）的结直肠癌患者中TLR9的表达量明显高于早期（I～II期）结直肠癌患者（P<0.05）。结论:1、TLR9在结直肠癌组织中表达上调,与癌旁组织中的表达相比差异具有统计学意义（P<0.05）;2、TLR9表达与结直肠癌患者的淋巴结转移、TNM分期相关,但与患者年龄、性别、发病部位及肿瘤分化程度不相关。第二部分:结直肠炎-癌动物模型的构建及TLR9和NF-κB在结肠炎-癌发生中的表达目的:构建结直肠炎-癌动物模型,探讨TLR9是否参与在结直肠炎-癌的发生及NF-κB的表达情况及两者相关性。方法:1、通过AOM和DSS两种药物的联合化学诱导以构建结直肠炎-癌BALB/c小鼠动物模型,记录小鼠体重、疾病活动度,小鼠大肠长度、炎症指数、肿瘤数量;2、H&E方法检测小鼠大肠黏膜病变,免疫组化方法检测大肠黏膜组织的TLR9、NF-κB及Ki67的表达,并分析其表达相关性。结果:1、我们利用AOM/DSS方法成功构建了BALB/c小鼠结直肠炎-癌动物模型。造模时间为23周,模型组（AOM+DSS）和DSS组小鼠的平均体重随时间下降,模型组小鼠的平均体重从实验开始的21.6±1.23 g降至第23周的19.5±0.7 g（P<0.05）,DSS小鼠的平均体重从实验开始的21.6±1.3 g降至第23周的20.8±0.8 g（P<0.05）,而反映结肠炎严重程度的DAI指数显著升高;2、造模第3周起,模型组及DSS组小鼠大肠平均长度开始小于其他组（P<0.05）,而实验后期,模型组的炎症程度及炎症范围较DSS组增加;3、造模第12周后,仅在模型组小鼠中观察到结直肠肿瘤。H&E病理结果表明,模型组小鼠分别在第3、6、12和18周出现大肠的急性炎症、慢性炎症、腺瘤和腺癌;4、与正常对照小鼠的相应组织相比,急性炎症、慢性炎症、腺瘤和腺癌组织中的TLR9明显上调（P<0.05）。此外,TLR9蛋白在腺癌中的表达较急性炎症、慢性炎症和腺瘤均显著上调（P<0.05）;5、NF-κB在急性炎症、慢性炎症、腺瘤和腺癌组织中的表达明显高于正常对照组小鼠的相应组织（P<0.05）。此外,与急性炎症和腺瘤组织相比,腺癌中的NF-κB表达显著升高（P<0.05）;6、与正常对照小鼠相应组织相比,Ki67在急性炎症、慢性炎症、腺瘤和腺癌组织中表达逐渐增加（P<0.05）;7.TLR9和NF-κB两者的表达呈现正相关（rho=0.8236,P<0.001）,TLR9和Ki67表达之间（rho=0.5515,P<0.0001）以及NF-κB和Ki67表达之间（rho=0.5103,P<0.01）也存在显著正相关。结论:1、我们成功构建结直肠炎-癌动物模型;2、TLR9与NF-κB参与结直肠炎-癌的发生;3、TLR9与NF-κB在结直肠炎-癌发生中存在相关性。第三部分:TLR9在结直肠癌中的作用的体外研究目的:探讨TLR9在人结直肠癌细胞系中的表达并研究TLR9对人结直肠癌细胞生物学行为的影响及相关机制。方法:1、Western blot检测正常肠黏膜上皮细胞FHC及结直肠癌细胞系SW620、Caco2、HCT116、HT29、Lovo中的表达;2、MTT法、细胞划痕实验及克隆形成实验检测TLR9的抑制剂氯喹及转染TLR9干扰质粒si RNA-TLR9对结直肠癌细胞系SW620、HT29的增殖能力、迁移能力及克隆形成能力等生物学功能的影响;3、Western blot检测氯喹及si RNA-TLR9处理结直肠癌SW620或HT29细胞后,TLR9、MMP9、PCNA、Bcl-xl蛋白的表达。结果:1、Western blot结果显示正常肠黏膜上皮细胞FHC及结直肠癌细胞系SW620、Caco2、HCT116、HT29、Lovo中均存在TLR9的蛋白表达,其中各结直肠癌细胞系中TLR9的表达明显高于FHC（P<0.05）。结直肠癌细胞系中,HT29及SW620的TLR9表达水平较高;2、MTT法、细胞划痕实验及克隆形成实验结果显示TLR9的抑制剂氯喹能抑制HT29及SW620细胞的增殖能力、迁移能力和克隆形成能力,存在剂量和时间依赖;3、MTT法、细胞划痕实验及克隆形成实验结果显示转染TLR9干扰质粒si RNA-TLR9能抑制SW620细胞的增殖能力、迁移能力和克隆形成能力;4、Western blot结果显示用氯喹处理SW620和HT29细胞后TLR9、MMP9、PCNA、Bcl-xl蛋白的表达下降;5、Western blot结果显示用si RNA-TLR9转染SW620细胞后,TLR9、MMP9、PCNA、Bcl-xl蛋白的表达下降,存在剂量依赖。结论:TLR9促进结直肠癌细胞增殖、迁移及克隆形成的作用,有望成为结直肠癌治疗的新靶点。抑制TLR9能降低下游MMP-9、PCNA和Bcl-xl表达。第四部分:TLR9调控NF-κB影响结直肠癌细胞生物学行为的机制研究目的:探讨TLR9调控NF-κB在结直肠癌中发挥相关作用的机制,通过转录组测序技术筛选出结直肠癌中与TLR9相关的基因,并寻找相关的肿瘤通路。方法:1、Western blot检测氯喹及si RNA-TLR9处理结直肠癌SW620或HT29细胞后NF-κB、My D88、p-Akt及p-ERK1/2等蛋白的表达;2、用免疫共沉淀法检测TLR9、NF-κB的相互作用;3、用免疫细胞化学法检测TLR9、NF-κB在结肠癌细胞内定位情况以及干预TLR9后NF-κB的表达;4、提取转染si RNA-TLR9和si RNA negative control的SW620细胞的总RNA,并进行Illumina（Hi Seq2500/4000）测序,检测差异表达基因,并对差异表达基因进行GO和KEGG功能及富集分析。结果:1、Western blot结果显示氯喹处理SW620或HT29细胞后NF-κB、My D88、p-Akt,p-ERK1/2等蛋白表达下降,存在剂量及时间依赖;2、Western blot结果显示,转染si RNA-TLR9后,SW620细胞NF-κB、My D88、p-Akt,p-ERK1/2等蛋白的表达下降,呈剂量依赖;3、免疫共沉淀结果显示TLR9、NF-κB及My D88在SW620细胞中以蛋白复合物的形式存在;4、用免疫细胞化学实验显示TLR9、NF-κB在SW620细胞存在共定位,转染si RNA-TLR9后NF-κB在细胞浆内表达下降;5、转录组测序筛选出85个差异表达基因,其中上调的基因47个,下调的基因38个;6、差异表达基因GO功能分析:参与生物过程的差异表达基因主要参与细胞转化、生物调节、代谢过程;参与细胞组分的差异表达基因主要参与细胞、细胞部分、细胞器;参与分子功能的差异表达基因主要参与螺旋、催化活性、转录调节活性;7、差异表达基因KEGG分析:KEGG通路分类和富集分析表明,这些差异表达基因参与了信号转导通路、长寿调节途径等途径,其中信号转导通路包括MAPK信号通路及雌激素信号通路。差异表达基因参与的细胞过程主要为细胞运输和分解代谢、细胞生长和死亡。结论:TLR9与NF-κB存在相互作用,TLR9直接作用于NF-κB进而激活下游信号,由此可能成为影响结直肠癌发生发展的主要机制。差异基因的GO和KEGG功能及富集分析显示这些基因能参与特定的功能和信号转导途径,提示TLR9在结直肠癌发生发展中具有独特的致病作用,转录组高通量测序为进一步研究TLR9在结直肠癌的发生发展机制提供实验基础和理论依据。