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TANK结合激酶1(TANK binding kinase-1,TBK1),属于非经典IκB激酶家族成员之一,是一种丝/苏氨酸激酶,它可通过磷酸化活化IRF3/7(Interferon regulatory Factor 3/7)或NF-κB(Nuclear factor-κB,NF-κB)进而活化相关的信号通路,诱导Ⅰ型干扰素及促炎细胞因子等抗病毒因子的产生,在TLRs(Toll-like receptors,TLRs)、RLRs(RIG-I-like receptors,RLRs)以及dsDNA受体介导的抗感染天然免疫中发挥重要作用。尽管TBK1通过磷酸化激活IRF3/7调控IFN(Interferon,IFN)产生的机制已较透彻,TBK1是否可以通过其它方式调控IFN产生尚不清楚。课题组前期研究发现,鸡细胞中TBK1(chicken TBK1,chTBK1)与chSTING(chicken STING,chSTING)互作,并可能参与chSTING诱导IFN产生过程。本研究对chTBK1调控chSTING激活IFN-β信号通路中的作用及调控机制进行探究。本研究克隆了chTBK1基因,序列分析结果表明chTBK1与哺乳动物TBK1的同源性达到80%以上,chTBK1的激酶结构域(aa 9-306)和泛素化结构域(aa 309-384)及C端螺旋结构域(aa 627-660)在进化上比较保守,物种间差距小。随后建立了快速有效的chTBK1基因实时荧光定量(qRT-PCR)检测方法,并利用该方法对chTBK1在健康鸡组织中的分布及H9N2亚型禽流感病毒(AIV)感染DF-1细胞后的表达变化进行检测,发现chTBK1在健康鸡不同组织器官中广泛分布,在脾脏和胸腺中表达量最高。DF-1细胞感染H9N2 AIV后,chTBK1的mRNA水平呈显著上调。通过免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)实验进一步证实chTBK1能够与chSTING发生相互作用,暗示chTBK1可能参与chSTING功能调节。通过基因过表达和RNA干扰实验发现,chTBK1能够抑制chSTING对IFN-β的激活。进一步的双荧光素酶报告基因实验发现,chTBK1激酶活性丧失突变体(chTBK1-S172A)对chSTING的IFN抑制作用解除,而丝/苏氨酸蛋白激酶chNEK7对chSTING激活IFN无抑制作用,表明chTBK1对chSTING的负调控依赖于其激酶活性并且具有激酶特异性。通过Western blot以及Mn2+-Phos-tag-SDS-PAGE实验发现,chTBK1能够使chSTING发生磷酸化,并抑制chSTING二聚体的形成。进一步对chSTING潜在的磷酸化位点进行分析预测并构建相应的突变体,结合Mn2+-Phos-tag-SDS-PAGE磷酸化蛋白检测方法,确定chTBK1能够催化chSTING五个丝氨酸位点发生磷酸化,分别为Ser285、Ser299、Ser327、Ser331、Ser362;通过chTBK1对chSTING不同丝氨酸突变体功能的影响研究,最终确定chSTING的Ser327和Ser331位点是chTBK1负调控chSTING的催化靶点。进一步研究发现,在chTBK1缺失的DF-1细胞中,chSTING却完全丧失激活IFN的功能,表明虽chTBK1对chSTING存在负调控作用,但chTBK1对于chSTING激活IFN是不可缺少的。综上所述,本研究揭示了chTBK1调控chSTING介导的Ⅰ型干扰素通路的新机制:chTBK1依赖其激酶活性,特异性地使chSTING的Ser327、Ser331位点发生磷酸化,抑制chSTING二聚体的形成,进而负向调控chSTING介导的IFNβ信号通路。研究结果为家禽病毒性疾病的防控与治疗提供了理论指导。