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研究背景:乳腺癌,大多诊断为恶性,虽然随着生活节奏和饮食规律的改变,近年来在男性中也不断出现确诊病例,但乳腺癌在女性中更为常见。让人头疼的是乳腺癌在不断“进化”后拥有着越来越高的发病率,更加不幸的是在年轻女性中不断有确诊病例的出现。赫赛汀(Herceptin)是一种人源化的可用于临床的注射用单克隆抗体,是一线治疗乳腺癌的药物,主要用于HER2(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2)过度表达的患者。Herceptin能够干扰HER2下游信号通路并最终抑制乳腺肿瘤的增长。但Herceptin的有效性受HER2表达情况的限制,而且病人耐药现象多有出现,多数发生在原本治疗有效的一年到两年内。目前针对Herceptin作用机制的研究已经相对成熟,而对其耐药机制的研究较少,因此深入研究其耐药机制就显得尤为重要,以便准确定位Herceptin治疗的群体,大大提升Herceptin治疗的有效性,最终达到减小Herceptin耐药在临床治疗中的阻力。目的:探究miR-6X(micro RNA-6X)调控Herceptin治疗敏感性的作用及其机制,为更好地实施乳腺癌抗HER2治疗,减少及避免耐药提供重要的理论依据和潜在的分子靶标。方法:首先,利用Herceptin耐药细胞株做micro RNA芯片检测,筛选耐药相关的micro RNA,找到表达下调明显且目前没有报道的miR-6X。接着,利用基因截短突变体和细胞荧光素酶活性实验找到受Herceptin调控的miR-6X启动子区域,再根据文献支持和数据预测寻找并确定结合在该启动子区域的转录因子CEBP(CCAAT Enhancer Binding Proteins);q RT-PCR(Quantitative Real-Time-Polymerase Chain Reaction)方法检测CEBP对miR-6X表达的影响;利用染色质免疫共沉淀技术检测CEBP是否募集到miR-6X启动子上并且这种募集是否受Herceptin影响;采用RNA干扰技术,敲低CEBP,q RT-PCR方法探究miR-6X变化情况;利用Western Blot检测miR-6X在蛋白水平对IGF1R(Insulin-like Growth Factor 1Receptor)表达的影响;利用报告基因活性实验技术,研究miR-6X是否直接靶向IGF1R;利用细胞耐药曲线和软琼脂形成实验,检测CEBP/miR-6X是否通过靶向IGF1R增加乳腺癌细胞对Herceptin敏感性;Western Blot检测CEBP/miR-6X是否通过靶向IGF1R抑制pAKT/pERK(phosphorylation Protein Kinase B/phosphorylation Extracellular Signal-Regulated Kinase)通路;细胞耐药曲线、软琼脂形成实验和Western Blot检测CEBP增加乳腺癌细胞对Herceptin敏感性是否通过miR-6X,另外也利用上述技术检测CEBP、miR-6X两者是否都通过pERK/pAKT通路增加Herceptin敏感性;活体成像和HE(Hematoxylin and Eosin)染色检测miR-6X在体内对乳腺癌肺转移的影响;RNA原位杂交、免疫组织化学和统计学分析检测CEBP、miR-6X和IGF1R在乳腺癌中表达情况以及两两之间的相关关系;免疫组织化学和生存期统计学分析分别检测接受和不接受Herceptin治疗患者中,CEBP/miR-6X高表达对无复发生存和总生存时间的影响。结果:1.利用Herceptin耐药细胞系MDA-MB-453/MDA-MB-453R提取总RNA,进行micro RNA芯片检测,寻找与Herceptin耐药有关的micro RNA,显示miR-6X下调最明显且目前没有报道。2.构建miR-6X截短突变体,转染ZR75-1细胞并分别设定加和不加Herceptin两个对照,检测细胞活性。找到miR-6X启动子区域中受Herceptin影响的区域,再根据数据库预测找到结合在该区域的转录因子CEBP。3.分别在ZR75-1/MCF-7/MDA-MB-453细胞中转染不同剂量的Myc-CEBP,提取总RNA并做micro RNA反转录,进行q RT-PCR检测,发现CEBP上调miR-6X表达且有剂量效应。4.对ZR75-1细胞分别做加和不加Herceptin处理,利用染色质免疫共沉淀技术检测发现:CEBP能募集到miR-6X启动子上并且这种募集受到Herceptin抑制。5.ZR75-1细胞中转染CEBP sh RNA1、CEBP sh RNA2,敲低CEBP,并做Herceptin处理对照,提取总RNA并做micro RNA反转录,q RT-PCR检测,发现Herceptin能下调miR-6X表达,而敲低CEBP后Herceptin不再能下调miR-6X表达。6.首先根据数据库预测寻找乳腺癌相关的癌基因,ZR75-1细胞中转染miR-6X,利用Western Blot找到miR-6X能够下调的基因,选定下调最明显且尚无报道的IGF1R;接着,在ZR75-1/MCF-7/MDA-MB-453分别转染miR-6X,发现转染miR-6X的IGF1R的蛋白水平明显低于对照组;而转染miR-6X inhibitor则IGF1R蛋白水平明显高于对照组。7.构建IGF1R 3’UTR(Universal Training Reactor)表达载体及其突变体,将miR-6X转入ZR75-1/MCF-7/MDA-MB-453细胞,测定报告基因活性,结果显示miR-6X降低IGF1R 3’UTR活性,而IGF1R 3’UTR突变后抑制作用消失。8.ZR75-1/MCF-7中转染IGF1R sh RNA和miR-6X后做细胞耐药曲线和软琼脂形成实验,发现:CEBP和miR-6X均能够增加乳腺癌细胞对Herceptin敏感性,但是敲低IGF1R之后,CEBP和miR-6X均不能够增加乳腺癌细胞对Herceptin敏感性。9.ZR75-1/MCF-7中转染IGF1R sh RNA和miR-6X后做Western Blot检测,发现CEBP和miR-6X均能够抑制pAKT/pERK通路,但是敲低IGF1R之后,CEBP和miR-6X均不能够抑制pAKT/pERK通路。10.ZR75-1中转染Myc-CEBP和miR-6X inhibitor后,做细胞耐药曲线、软琼脂形成实验和Western Blot检测,发现:CEBP增加乳腺癌细胞对Herceptin敏感性,而敲低miR-6X后,CEBP不能增加乳腺癌细胞对Herceptin敏感性;CEBP能够抑制IGF1R蛋白水平和pAKT/pERK通路,而敲低miR-6X后抑制作用消失。11.ZR75-1中转染Myc-CEBP并加入LY(AKT抑制剂)/PD(ERK抑制剂)后,进行细胞耐药曲线和软琼脂形成实验,发现:CEBP增加Herceptin敏感性,而抑制pAKT/pERK通路后,CEBP不能增加乳腺癌细胞对Herceptin敏感性。12.ZR75-1中转染miR-6X并加入LY/PD后,进行细胞耐药曲线和软琼脂形成实验,发现:miR-6X增加乳腺癌细胞对Herceptin敏感性,而抑制pAKT/pERK通路后,miR-6X不能增加乳腺癌细胞对Herceptin敏感性。13.给成瘤的裸鼠注射miR-6X Ago-miR和Herceptin,进行活体成像检测发现:miR-6X Ago-miR可以抑制乳腺癌的转移,并且miR-6X Ago-miR可以增加Herceptin敏感性;解剖裸鼠;HE染色肺部,发现:miR-6X在体内抑制乳腺癌肺转移,并可以增加乳腺癌细胞对Herceptin敏感性。14.乳腺癌标本做RNA原位杂交并统计分析,发现CEBP和miR-6X:癌中表达明显高于癌旁;而IGF1R在乳腺癌中:癌中表达明显低于癌旁。15.乳腺癌标本做免疫组织化学和统计学分析,发现CEBP和miR-6X的表达成正相关关系,CEBP/miR-6X和IGF1R的表达均成负相关。16.对103例接受Herceptin治疗的乳腺癌患者的无复发生存和总生存时间做统计学分析,发现CEBP/miR-6X高表达时,无复发生存和总生存的时间更长,P值有意义;对109例未接受Herceptin治疗的乳腺癌患者的无复发生存和总生存时间做统计学分析,结果和接受Herceptin治疗的群体一样,但P值无意义。结论:1.miR-6X是与Herceptin耐药有关的micro RNA之一2.Herceptin通过抑制miR-6X的转录因子CEBP抑制miR-6X,使IGF1R表达下调,抑制下游pAKT/pERK通路,从而导致乳腺癌对Herceptin敏感性。