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[研究背景]
流行病学研究表明病程缓慢且持续发展的帕金森病(Parkinsons Disease，PD)是仅次于AD次常见的神经变性疾病。PD的典型病理包括中脑黑质(substantia nigra，SN)中的DA神经元异常凋亡及纹状体(striatum，STR)中的DA缺乏，同时，在神经元的胞质中出现由α-突触核蛋白(α-synuclein，α-SYN)聚集所构成的路易小体(Lewy body，LB)。随着病程进展，PD患者将出现运动及非运动的临床症状。PD的致病因素复杂多样，目前尚不清楚。
E3泛素连接酶TRIM31，能泛素化特定的靶分子参与多种不同的细胞生物学过程。目前，研究发现TRIM31与肿瘤和炎症性疾病有关，而TRIM31与PD的关系尚无相关报道。本课题组前期的研究中发现，TRIM31在野生小鼠黑质和纹状体有明显的表达，与野生型小鼠相比，TRIM31缺失小鼠会加重由MPTP或6-OHDA诱导的多巴胺能神经损伤。这提示TRIM31在PD的疾病发展中有着重要的作用，但是具体机制尚不清楚。近期研究发现线粒体外膜蛋白VDAC1是维持线粒体稳态的重要靶点，与PD发病机制密切相关，泛素化修饰作为VDAC1的一种重要的调控方式值得深入探讨。因此，本文将深入探讨TRIM31调控VDAC1泛素化修饰的机制及其在PD病理进程中的作用，为临床防治PD提供新的靶点。
[研究目的]
本课题利用TRIM31基因敲除小鼠，MPTP化学刺激诱导PD模型和α-SYN(A53T)转基因PD模型，以TRIM31对VDAC1的调控为核心，深入探究TRIM31参与PD病理进程的效应与分子机制。
[研究方法]
1.探究生理状态下，TRIM31缺失对小鼠的影响。
1.1通过MORRIS水迷宫实验和转棒实验检测2-12月龄野生型小鼠和TRIM31-/-小鼠的学习、记忆及运动能力变化情况。
1.2通过Westernblot检测2、6、8月龄野生型小鼠和TRIM31-/-小鼠的PD相关蛋白标志物变化情况。
1.3使用免疫组化方法检测8月龄野生型小鼠和TRIM31-/-小鼠的黑质及纹状体中TH的变化情况。
2.探究生理状态下，TRIM31缺失对小鼠线粒体功能的影响。
2.1使用Real-timePCR方法检测2、6、8月龄野生型小鼠和TRIM31-/-小鼠线粒体DNA变化情况。
2.2通过Westernblot检测2、6、8月龄野生型小鼠和TRIM31-/-小鼠黑质和纹状体中线粒体相关蛋白变化情况。
2.3使用透射电镜观察2、8月龄野生型小鼠和TRIM31-/-小鼠黑质中线粒体形态及数量的变化。
3.在PD模型状态下，检测TRIM31的表达。
3.1体外培养小鼠中脑多巴胺能神经元株MN9D，通过转染α-synuclein(A53T)质粒建立体外PD模型，于转染后24h收取细胞。使用Real-timePCR方法检测对照组及模型组TRIM31的RNA变化情况。
3.2通过Westernblot检测对照组和模型组细胞中TRIM31的变化情况。
4.在PD模型状态下，检测PD蛋白标志物的表达。
4.1观测细胞中酪氨酸羟化酶(TH)和磷酸化的α-synuclein蛋白变化情况。
4.2使用免疫组化方法检测野生型小鼠和TRIM31-/-小鼠黑质中α-synuclein的变化情况。
5.在PD模型状态下，检测细胞apoptosis相关蛋白改变。
5.1敲低TRIM31后，MPP+刺激培养24h。观测细胞中细胞色素C、Bcl-2/BAX、剪切形式Caspase9(Cas 9)、剪切形式Caspase3(Cas 3)的蛋白改变情况。
5.2敲低TRIM31后，MPP+刺激培养24h。通过TUNEL荧光检测细胞凋亡情况。
5.3过表达TRIM31后，MPP+刺激培养24h。观测细胞中细胞色素C、Bcl-2/BAX、剪切形式Cas9、剪切形式Cas3改变情况。
5.4在由MPTP诱导的TRIM31-/-小鼠中，观测细胞中细胞色素C、Bcl-2/BAX、剪切形式Cas9、剪切形式Cas3改变情况。
5.5在由MPTP诱导的TRIM31-/-小鼠中，通过TUNEL组化检测黑质中神经元凋亡情况。
6.探究TRIM31对VDAC1的调节作用。
6.1梯度过表达TRIM31后，检测细胞中VDAC1蛋白水平的变化。
6.2过表达或敲低TRIM31后，在PD模型中检测VDAC1蛋白水平的变化。
6.3过表达或敲低TRIM31后，分别使用MG132、Chloroquine、Cyclohexanone，后，检测VDAC1蛋白水平的变化。
7.探究TRIM31与VDAC1的相互作用。
7.1通过激光共聚焦检测TRIM31和VDAC1在神经细胞中的共定位情况。
7.2检测TRIM31与VDAC1的外源性结合。在HEK-293T细胞中转染GFP-TRIM31和Flag-VDAC1质粒后，使用CO-IP实验检测体外结合情况。
7.3检测TRIM31与VDAC1的内源性结合。在SH-SY5Y细胞中给与MPP+刺激后，使用CO-IP实验检测内源结合情况。
7.4检测TRIM31与VDAC1的结合部位。在HEK-293T细胞中，通过转染Myc-VDAC1、Myc-VDAC1(△25)、Flag-TRIM31(△R)、Flag-TRIM31(△N)、Flag-TRIM31(△C)、Flag-TRIM31(△CC)质粒后，免疫沉淀后Westernblot检测结合情况。
8.探究TRIM31对VDAC1泛素化的影响。
8.1在HEK-293T细胞中，转染Flag-TRIM31(WT)、和Flag-TRIM31(C53A，C56A)、Myc-VDAC1、HA-Ubiquitin质粒后，使用CO-IP实验检测VDAC1的外源泛素化情况。
8.2在HEK-293T细胞中，转染GFP-TRIM31、Flag-VDAC1、HA-Ubiquitin(WT)、HA-Ubiquitin(K48)、HA-Ubiquitin(K63)质粒后，使用免疫共沉淀实验，Westernblot检测VDAC1的泛素化作用形式。
9.探究TRIM31对VDAC1寡聚化的影响。敲低或过表达TRIM31后，在HEK-293T细胞中使用半变性琼脂糖凝胶检测VDAC1的寡聚化情况。
[研究结果]
1.在生理条件下，与野生型小鼠相比，TRIM31-/-小鼠的学习、记忆和运动能力均出现损伤，且随着小鼠年龄增加，情况愈发严重，在8月龄时表现最为明显。
2.在生理状态下，与野生小鼠相比，电镜观察到8月龄TRIM31-/-小鼠黑质的线粒体出现肿胀、空泡化和线粒体嵴模糊。
3.在生理条件下，与野生型小鼠相比，TRIM31-/-小鼠黑质中TH蛋白有所减少，α-synuclein蛋白增加。免疫组化表明，TRIM31-/-小鼠黑质和纹状体中TH阳性细胞明显减少。
4.在生理条件下，与野生型小鼠相比，8月龄TRIM31-/-小鼠黑质中mtDNA缺失水平上升，黑质和纹状体中线粒体相关蛋白PGC-1α、OPA1、MFN1、MFN2、Bcl-2/BAX水平降低，VDAC1蛋白水平升高，DRP1、TOM20未有明显变化。
5.在转染α-synuclein(A53T)质粒建立的体外PD模型中，与对照组相比，模型组TRIM31的mRNA和蛋白水平，P-α-synuclein蛋白水平明显升高。免疫组化检测到，TRIM31-/-小鼠黑质中α-synuclein阳性细胞明显增加。
6.在体外培养的SH-SY5Y细胞中给与MPP+刺激后，敲低TRIM31使凋亡相关蛋白细胞色素C、剪切形式Cas9、剪切形式Cas3水平明显升高，而Bcl-2/BAX比率明显下降，此外，TUNEL阳性细胞数量明显增多。在MPTP诱导的小鼠PD模型中，黑质中凋亡相关蛋白出现相同变化趋势。同时，在过表达TRIM31后，凋亡相关蛋白在细胞中出现相反趋势。
7.在HEK-293T细胞中，梯度过表达TRIM31后，VDAC1水平出现相应减少。且在神经细胞中，敲低或过表达TRIM31后，VDAC1水平分别表现出明显增加和减少。此外，MG132可抑制TRIM31引起的VDAC1的降解，而在使用CQ后，作用不明显。同时，使用CHX抑制VDAC1蛋白的从头合成，敲低TRIM31后VDAC1的降解明显减少，而过表达TRIM31后VDAC1降解明显。
8.在寡聚化实验中，敲低TRIM31后可以使VDAC1寡聚化水平显著增加，同时，过表达TRIM31后，VDAC1寡聚化水平显著下降。
9.激光共聚焦观察到TRIM31与VDAC1在神经细胞中具有共定位，而且TRIM31和VDAC1外源和内源的免疫共沉淀实验中均存在结合。此外，我们进一步发现TRIM31通过其coiled-coil结构域与VDAC1的β-barrel结构域相互作用。
10.外源泛素化实验中，TRIM31可通过其E3泛素连接酶活性促进VDAC1的泛素化。此外，进一步研究表明，TRIM31通过催化VDAC1上Lys48(K48)连接的多聚泛素化，使其降解发挥作用。
[研究结论]
TRIM31-/-小鼠表现出自发的行为学损伤改变和线粒体功能障碍。此外，TRIM31通过与VDAC1直接相互作用，催化Lysine48(K48)上连接的多聚泛素化，促使VDAC1降解，抑制其寡聚化，从而延缓神经细胞凋亡进程，在PD中发挥保护作用。
流行病学研究表明病程缓慢且持续发展的帕金森病(Parkinsons Disease，PD)是仅次于AD次常见的神经变性疾病。PD的典型病理包括中脑黑质(substantia nigra，SN)中的DA神经元异常凋亡及纹状体(striatum，STR)中的DA缺乏，同时，在神经元的胞质中出现由α-突触核蛋白(α-synuclein，α-SYN)聚集所构成的路易小体(Lewy body，LB)。随着病程进展，PD患者将出现运动及非运动的临床症状。PD的致病因素复杂多样，目前尚不清楚。
E3泛素连接酶TRIM31，能泛素化特定的靶分子参与多种不同的细胞生物学过程。目前，研究发现TRIM31与肿瘤和炎症性疾病有关，而TRIM31与PD的关系尚无相关报道。本课题组前期的研究中发现，TRIM31在野生小鼠黑质和纹状体有明显的表达，与野生型小鼠相比，TRIM31缺失小鼠会加重由MPTP或6-OHDA诱导的多巴胺能神经损伤。这提示TRIM31在PD的疾病发展中有着重要的作用，但是具体机制尚不清楚。近期研究发现线粒体外膜蛋白VDAC1是维持线粒体稳态的重要靶点，与PD发病机制密切相关，泛素化修饰作为VDAC1的一种重要的调控方式值得深入探讨。因此，本文将深入探讨TRIM31调控VDAC1泛素化修饰的机制及其在PD病理进程中的作用，为临床防治PD提供新的靶点。
[研究目的]
本课题利用TRIM31基因敲除小鼠，MPTP化学刺激诱导PD模型和α-SYN(A53T)转基因PD模型，以TRIM31对VDAC1的调控为核心，深入探究TRIM31参与PD病理进程的效应与分子机制。
[研究方法]
1.探究生理状态下，TRIM31缺失对小鼠的影响。
1.1通过MORRIS水迷宫实验和转棒实验检测2-12月龄野生型小鼠和TRIM31-/-小鼠的学习、记忆及运动能力变化情况。
1.2通过Westernblot检测2、6、8月龄野生型小鼠和TRIM31-/-小鼠的PD相关蛋白标志物变化情况。
1.3使用免疫组化方法检测8月龄野生型小鼠和TRIM31-/-小鼠的黑质及纹状体中TH的变化情况。
2.探究生理状态下，TRIM31缺失对小鼠线粒体功能的影响。
2.1使用Real-timePCR方法检测2、6、8月龄野生型小鼠和TRIM31-/-小鼠线粒体DNA变化情况。
2.2通过Westernblot检测2、6、8月龄野生型小鼠和TRIM31-/-小鼠黑质和纹状体中线粒体相关蛋白变化情况。
2.3使用透射电镜观察2、8月龄野生型小鼠和TRIM31-/-小鼠黑质中线粒体形态及数量的变化。
3.在PD模型状态下，检测TRIM31的表达。
3.1体外培养小鼠中脑多巴胺能神经元株MN9D，通过转染α-synuclein(A53T)质粒建立体外PD模型，于转染后24h收取细胞。使用Real-timePCR方法检测对照组及模型组TRIM31的RNA变化情况。
3.2通过Westernblot检测对照组和模型组细胞中TRIM31的变化情况。
4.在PD模型状态下，检测PD蛋白标志物的表达。
4.1观测细胞中酪氨酸羟化酶(TH)和磷酸化的α-synuclein蛋白变化情况。
4.2使用免疫组化方法检测野生型小鼠和TRIM31-/-小鼠黑质中α-synuclein的变化情况。
5.在PD模型状态下，检测细胞apoptosis相关蛋白改变。
5.1敲低TRIM31后，MPP+刺激培养24h。观测细胞中细胞色素C、Bcl-2/BAX、剪切形式Caspase9(Cas 9)、剪切形式Caspase3(Cas 3)的蛋白改变情况。
5.2敲低TRIM31后，MPP+刺激培养24h。通过TUNEL荧光检测细胞凋亡情况。
5.3过表达TRIM31后，MPP+刺激培养24h。观测细胞中细胞色素C、Bcl-2/BAX、剪切形式Cas9、剪切形式Cas3改变情况。
5.4在由MPTP诱导的TRIM31-/-小鼠中，观测细胞中细胞色素C、Bcl-2/BAX、剪切形式Cas9、剪切形式Cas3改变情况。
5.5在由MPTP诱导的TRIM31-/-小鼠中，通过TUNEL组化检测黑质中神经元凋亡情况。
6.探究TRIM31对VDAC1的调节作用。
6.1梯度过表达TRIM31后，检测细胞中VDAC1蛋白水平的变化。
6.2过表达或敲低TRIM31后，在PD模型中检测VDAC1蛋白水平的变化。
6.3过表达或敲低TRIM31后，分别使用MG132、Chloroquine、Cyclohexanone，后，检测VDAC1蛋白水平的变化。
7.探究TRIM31与VDAC1的相互作用。
7.1通过激光共聚焦检测TRIM31和VDAC1在神经细胞中的共定位情况。
7.2检测TRIM31与VDAC1的外源性结合。在HEK-293T细胞中转染GFP-TRIM31和Flag-VDAC1质粒后，使用CO-IP实验检测体外结合情况。
7.3检测TRIM31与VDAC1的内源性结合。在SH-SY5Y细胞中给与MPP+刺激后，使用CO-IP实验检测内源结合情况。
7.4检测TRIM31与VDAC1的结合部位。在HEK-293T细胞中，通过转染Myc-VDAC1、Myc-VDAC1(△25)、Flag-TRIM31(△R)、Flag-TRIM31(△N)、Flag-TRIM31(△C)、Flag-TRIM31(△CC)质粒后，免疫沉淀后Westernblot检测结合情况。
8.探究TRIM31对VDAC1泛素化的影响。
8.1在HEK-293T细胞中，转染Flag-TRIM31(WT)、和Flag-TRIM31(C53A，C56A)、Myc-VDAC1、HA-Ubiquitin质粒后，使用CO-IP实验检测VDAC1的外源泛素化情况。
8.2在HEK-293T细胞中，转染GFP-TRIM31、Flag-VDAC1、HA-Ubiquitin(WT)、HA-Ubiquitin(K48)、HA-Ubiquitin(K63)质粒后，使用免疫共沉淀实验，Westernblot检测VDAC1的泛素化作用形式。
9.探究TRIM31对VDAC1寡聚化的影响。敲低或过表达TRIM31后，在HEK-293T细胞中使用半变性琼脂糖凝胶检测VDAC1的寡聚化情况。
[研究结果]
1.在生理条件下，与野生型小鼠相比，TRIM31-/-小鼠的学习、记忆和运动能力均出现损伤，且随着小鼠年龄增加，情况愈发严重，在8月龄时表现最为明显。
2.在生理状态下，与野生小鼠相比，电镜观察到8月龄TRIM31-/-小鼠黑质的线粒体出现肿胀、空泡化和线粒体嵴模糊。
3.在生理条件下，与野生型小鼠相比，TRIM31-/-小鼠黑质中TH蛋白有所减少，α-synuclein蛋白增加。免疫组化表明，TRIM31-/-小鼠黑质和纹状体中TH阳性细胞明显减少。
4.在生理条件下，与野生型小鼠相比，8月龄TRIM31-/-小鼠黑质中mtDNA缺失水平上升，黑质和纹状体中线粒体相关蛋白PGC-1α、OPA1、MFN1、MFN2、Bcl-2/BAX水平降低，VDAC1蛋白水平升高，DRP1、TOM20未有明显变化。
5.在转染α-synuclein(A53T)质粒建立的体外PD模型中，与对照组相比，模型组TRIM31的mRNA和蛋白水平，P-α-synuclein蛋白水平明显升高。免疫组化检测到，TRIM31-/-小鼠黑质中α-synuclein阳性细胞明显增加。
6.在体外培养的SH-SY5Y细胞中给与MPP+刺激后，敲低TRIM31使凋亡相关蛋白细胞色素C、剪切形式Cas9、剪切形式Cas3水平明显升高，而Bcl-2/BAX比率明显下降，此外，TUNEL阳性细胞数量明显增多。在MPTP诱导的小鼠PD模型中，黑质中凋亡相关蛋白出现相同变化趋势。同时，在过表达TRIM31后，凋亡相关蛋白在细胞中出现相反趋势。
7.在HEK-293T细胞中，梯度过表达TRIM31后，VDAC1水平出现相应减少。且在神经细胞中，敲低或过表达TRIM31后，VDAC1水平分别表现出明显增加和减少。此外，MG132可抑制TRIM31引起的VDAC1的降解，而在使用CQ后，作用不明显。同时，使用CHX抑制VDAC1蛋白的从头合成，敲低TRIM31后VDAC1的降解明显减少，而过表达TRIM31后VDAC1降解明显。
8.在寡聚化实验中，敲低TRIM31后可以使VDAC1寡聚化水平显著增加，同时，过表达TRIM31后，VDAC1寡聚化水平显著下降。
9.激光共聚焦观察到TRIM31与VDAC1在神经细胞中具有共定位，而且TRIM31和VDAC1外源和内源的免疫共沉淀实验中均存在结合。此外，我们进一步发现TRIM31通过其coiled-coil结构域与VDAC1的β-barrel结构域相互作用。
10.外源泛素化实验中，TRIM31可通过其E3泛素连接酶活性促进VDAC1的泛素化。此外，进一步研究表明，TRIM31通过催化VDAC1上Lys48(K48)连接的多聚泛素化，使其降解发挥作用。
[研究结论]
TRIM31-/-小鼠表现出自发的行为学损伤改变和线粒体功能障碍。此外，TRIM31通过与VDAC1直接相互作用，催化Lysine48(K48)上连接的多聚泛素化，促使VDAC1降解，抑制其寡聚化，从而延缓神经细胞凋亡进程，在PD中发挥保护作用。