PUB19启动子的结构分析及其应用研究

来源 :西南科技大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:hujun_xiao
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在植物转基因工程中,通常是将一个外源基因导入到受体植株体内,以改善和增强植株某方面的品质。而外源基因在受体植株内的表达时间、表达部位以及表达量,依靠其上游的启动子来控制,因此该启动子的特性决定了外源基因的表达特点。  当前,在转基因工程中,应用最广泛的启动子是35S启动子。该启动子能够调控外源基因在植株体内的各组织部位持续表达且表达水平也较稳定。然而,外源基因的持续表达会导致表达产物累积,会对植株正常生长带来一些负面影响,如造成资源浪费,加重植株新陈代谢负担。  因此,在植物转基因工程中,研究和开发一个具有时空特异性的启动子来驱动外源基因的时空特异性表达,对改善植物生长性状、减轻植物代谢负担、提升植物品质具有非常重要的意义。  鉴于PUB19启动子在拟南芥中受低温、干旱、高盐和ABA诱导,其表现出明显的时空特异性。本研究首先构建了PUB19启动子驱动的IrrE基因植物表达载体pCambia-PUB19::IrrE,然后将其转化到农杆菌EHA105中;接着以农杆菌介导的方法,将重组质粒pCambia-PUB19::IrrE转化油菜,并对转化苗进行抗性筛选和PCR阳性检测;在鉴定到转PUB19::IrrE基因油菜苗的基础上,最后进行IrrE基因的表达特性研究和对转PUB19::IrrE基因植株的抗盐性能力鉴定。  目前,主要取得以下结果:  (1)利用PLACE和PlantCARE数据库对PUB19启动子的序列进行结构分析。结果显示,PUB19启动子不仅含有TATA-box、CAAT-box等基因起始转录的必要元件;还含有多种具有特异性的顺式作用元件,这些元件主要是:与ABA应答相关的ABRE、与热击响应的HSE、MYB的结合位点且与干旱诱导相关的MBS、与病原菌和NaCl响应的GT1-motif、与生长素和水杨酸响应的TGACG-motif、与脱水、低温和盐胁迫响应的DRE和MYBCORE等。  (2)在载体 pCambia-PUB19::gus的基础上,成功构建了植物表达载体pCambia-PUB19::IrrE;通过冻融法将其转化大肠杆菌和农杆菌,再以农杆菌介导的方法,将重组载体pCambia-PUB19::IrrE转化油菜,经过抗性筛选和PCR阳性检测后,共获得转PUB19::IrrE基因阳性油菜苗43株。  (3)在多种胁迫条件下,通过实时荧光定量PCR技术,检测IrrE基因在转PUB19::IrrE基因油菜叶片中的相对表达水平。结果显示,PEG、Cold、NaCl、ABA、Hot非生物胁迫可诱导PUB19启动子驱动IrrE基因油菜叶片中以较高水平表达,而 H2O、SA不能诱导 PUB19启动子驱动 IrrE基因在叶片中表达;表明PUB19启动子在油菜中受多种非生物胁迫诱导。  (4)在不同浓度NaCl胁迫下,通过实时荧光定量PCR技术,检测IrrE基因在转PUB19::IrrE基因油菜叶片中的相对表达水平。结果显示,在0 mmol/L NaCl胁迫下,IrrE基因在转 PUB19::IrrE基因油菜叶片中不表达;而在低浓度(100 mmol/L)和高浓度(200、300和400 mmol/L)NaCl胁迫下,PUB19启动子驱动的IrrE基因在转基因油菜叶片的相对表达水平较高,并且高于35S启动子驱动下的 IrrE的相对表达水平;表明 PUB19启动子驱动基因的表达效率高于35S启动子。  (5)在不同浓度NaCl胁迫下,鉴定转PUB19::IrrE基因植株的抗盐胁迫能力。结果显示,在高浓度(200、300和400mmol/L)NaCl胁迫下,转PUB19::IrrE基因油菜植株叶片的抗氧化酶活性(如POD、SOD、CAT活性)、渗透调节能力(如脯氨酸和可溶性糖含量)以及细胞膜结构的完整性(如MDA和相对电导率)均强于转35S::IrrE基因植株和非转基因植株;表明PUB19启动子驱动IrrE基因的高效表达增强了植株的抗盐胁迫能力。
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