论文部分内容阅读
移植是治疗器官功能衰竭的有效手段,移植排斥反应是移植物丢失的主要原因。CD4+T细胞是介导移植排斥反应的重要细胞,不同CD4+T细胞亚群在移植排斥反应中功能各不相同。Th1及Th17细胞加速移植排斥,而Th2及Treg细胞则诱导移植物耐受。目前广泛使用的免疫抑制药物,如环孢素A、FK506及雷帕霉素等,通过抑制整个T细胞亚群的增殖分化来调控移植排斥反应,存在明显的局限性。因此,发展选择性抑制T细胞亚群的新型免疫抑制剂是未来抗排斥药物研究的方向。研究移植状态下T细胞亚群分化调节机制,对于理解移植排斥反应病理生理和发展选择性干预T细胞的抗排斥反应药物具有十分重要的意义。Th17是CD4+T细胞的重要亚群,因主要分泌细胞因子IL-17得名。IL-17可向炎症部位募集大量单核细胞、中性粒细胞或与其它炎症因子共同作用参与调节免疫炎症反应。Th17细胞在过敏性哮喘、糖尿病、银屑病、SLE及移植排斥反应中具有重要作用。研究发现,Th17细胞局部浸润与移植肾功能及肾组织损伤的严重程度显著相关。运用特异性抗体阻断IL-17A,小鼠移植肺中淋巴细胞及IFN-γ阳性细胞浸润显著降低,且阻塞性支气管炎显著缓解。研究移植状态下Th17细胞分化调控机制,对开发特异性调节药物具有重要的价值。补体是天然免疫系统的重要组分。研究表明,补体参与调节T细胞增殖分化。CD4+T细胞上表达补体受体C3a R及C5a R,与补体活化产物C3a及C5a结合后,激活G蛋白下游通路,促进T细胞增殖分化及Th1细胞应答。同种异基因小鼠肾移植中补体C5a R基因缺陷显著延长移植物存活,T细胞应答明显减弱,表明同种异基因移植排斥反应中补体参与调节T细胞增殖分化。然而,同种异基因移植中补体活化是否与Th17细胞存在关联并参与调节Th17细胞增殖分化尚不清楚。补体C3是补体系统的枢纽分子。补体C3基因缺陷时,Th1/Th17细胞应答衰减,同时补体C3参与调节Treg细胞增殖分化及功能发挥,提示同种异基因移植中补体C3可能参与调节Treg/Th17细胞应答,在移植排斥反应中发挥重要作用。【研究目的】1、研究同种异基因移植过程中补体的活化及Th17细胞增殖分化的关联;2、建立同种异基因移植模型,明确补体组分C3对移植物存活及Th17细胞应答的影响;3、深入探讨补体C3对同种异基因移植排斥反应中Th17细胞应答的调控机制。【研究方法】1、同种异基因移植中补体的活化及Th17细胞的增殖分化1)收集肾移植患者外周血,分离PBMC及血清,FCM检测移植排斥过程中Th17细胞增殖分化,ELISA检测补体活化片段C3a及C5a含量,明确移植过程中补体活化情况;2)收集发生急慢性排斥反应及正常肾组织,IHC检测肾组织中补体活化、IL-17表达、T细胞浸润,免疫荧光染色IF检测排斥肾组织中Th17细胞浸润情况。3)培养人近端肾小管上皮细胞(HK2),以补体活化产物C3a刺激后,IHC检测HK2中IL-17的分泌。4)补体活化产物C5a刺激HK2后,IHC及FCM检测HK2中IL-17的分泌。2、同种异基因移植中补体组分C3对移植物存活及Th17细胞应答的影响1)Bm12,C3+/+及C3-/-小鼠尾部皮肤分别移植到Bm12小鼠背部,7天后观察移植物排斥反应,明确局部补体C3缺乏对同种异基因移植物存活的影响;2)Bm12小鼠尾部皮肤分别移植到C3+/+或者C3-/-小鼠背部,7天后观察移植物排斥反应,明确系统性补体C3缺乏对同种异基因移植物存活的影响。3)通过HE、IHC及IF染色检测移植物局部中性粒细胞、巨噬细胞、Th17细胞及DC等浸润情况,q PCR检测移植物局部炎症因子及趋化因子表达情况。4)移植不同时间点,取Bm12小鼠腋窝引流淋巴结及脾脏,FCM检测Th1/17细胞频率,明确补体C3缺陷对Th1/17细胞应答的影响。3、同种异基因移植中补体组分C3对Th17细胞应答的调节机制1)移植10天后,取Bm12小鼠腋窝引流淋巴结,MLR检测补体C3缺陷对淋巴细胞增殖的影响。2)移植不同时间点,取Bm12小鼠腋窝引流淋巴结及脾脏,FCM检测Treg细胞频率,明确在此模型中补体C3缺陷对Treg细胞应答的影响。3)利用Anti-CD25 mAb去除Treg细胞后,观察C3-/-移植物存活情况,深入探讨Treg细胞在延长C3-/-移植物存活中的重要作用。4)分离纯化Na?ve CD4+T细胞与辐照后的BMDCs共培养9-12天,收集上清检测IL-10的分泌,收集细胞通过PCR及FCM检测Treg细胞增殖分化情况。【研究结果】1、同种异基因移植中,补体大量活化及Th17细胞应答增强1)与移植前相比,同种异基因肾移植后患者血清中补体活化片段C3a及C5a浓度显著增加;发生排斥反应肾组织中补体C3、补体受体C5a R及补体活化终产物C5b-9较正常肾组织表达明显增加。2)与移植前相比,同种异基因肾移植后患者PBMCs中Th17细胞频率升高;排斥反应肾组织中Th17细胞浸润显著增加。3)与未刺激组相比,补体活化产物C3a及C5a刺激显著上调IL-17表达。2、局部补体组分C3缺陷显著延长同种异基因移植物存活时间并衰减Th17细胞应答1)来源于C3+/+移植物在移植后17天被完全排斥,与之不同的是,来源于C3-/-移植物存活时间显著延长,60%C3-/-B6移植物存活时间超过30天,表明移植物局部C3基因缺陷可延长MHC-Ⅱ不匹配同种异基因移植物存活时间。2)Bm12移植物存活时间在C3+/+及C3-/-两种小鼠间没有差异,移植物存活时间均小于14天,表明系统性C3缺陷不能延长同种异基因移植物存活时间。3)HE染色发现,C3-/-移植物组织坏死、单核细胞浸润显著减轻;IHC检测发现,C3-/-移植物中性粒细胞、巨噬细胞及T细胞浸润显著减少;IF检测发现,C3-/-移植物局部Th17细胞浸润明显减少。4)q PCR检测发现,C3-/-移植物中Th1/Th17细胞应答关键炎症因子,如细胞因子IFN-γ、IL-17及IL-23,趋化因子CXCL-9,mRNA表达显著降低。与之相似的是炎症因子IL-1β、IL-6及TNF-α在C3-/-移植物表达亦显著衰减。表明,移植物局部补体C3缺乏导致Th1/Th17细胞应答相关炎症因子及趋化因子表达降低。5)FCM检测发现,C3-/-移植物显著降低Th1/17细胞频率,表明同种异基因移植中补体C3促进Th1/17细胞应答。3、同种异基因移植排斥中,补体组分C3抑制Treg细胞增殖分化,促进Th17细胞应答,加速排斥反应发生1)MLR实验发现,补体C3基因缺陷时淋巴细胞增殖显著降低。2)PCR及IHC检测移植物中Treg细胞特异性转录因子Foxp3表达,发现C3-/-移植物中Foxp3表达显著上升,表明C3-/-移植物存活延长可能与Treg的密切相关。3)FCM检测Bm12小鼠脾脏及引流淋巴结中Treg细胞频率,发现,C3-/-移植物显著增加Treg细胞频率,表明C3-/-移植物存活延长可能依赖于Treg细胞的扩增。4)Anti-CD25 m Ab去除Treg细胞后观测C3-/-移植物存活,发现,去除Treg细胞后Th17细胞应答增强,C3-/-移植物存活时间显著缩短,排斥反应明显增强,表明Treg在促进C3-/-移植物存活延长中发挥关键作用。5)IF检测发现,C3-/-移植物中DCs浸润明显减少,共刺激分子CD80表达减弱;通过将BMDCs与Na?ve CD4+T细胞共培养,发现,与C3+/+DCs相比,C3-/-DCs能够显著促进IL-10的分泌,Foxp3表达及Tregs增殖分化,表明补体C3通过DCs抑制Tregs细胞增殖分化。【主要结论】本研究中,我们通过收集临床同种异基因肾移植标本,检测补体活化及Th17细胞增殖分化;通过体外细胞实验,检测补体活化产物对IL-17产生的影响;建立同种异基因移植模型,明确补体组分C3对移植物存活及Th17细胞应答的影响;深入探讨补体C3在同种异基因移植排斥中对Th17细胞应答的调控机制,得出主要结论如下:1、同种异基因移植过程中,补体的大量活化与Th17细胞应答紧密相关;2、同种异基因移植中,补体C3缺陷显著延长移植物的存活时间并衰减Th17细胞应答;3、同种异基因移植排斥反应中,补体组分C3抑制Tregs细胞增殖分化,促进Th17细胞应答,加速排斥反应发生。