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口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma,OSCC）约占口腔癌所有类型的90%,是全球最常见的癌症之一。口腔潜在恶性疾病（oral potentially malignant disorders,OPMDs）包括口腔白斑（oral leukoplakua,OLK）、口腔扁平苔藓、口腔红斑、盘状红斑狼疮、口腔黏膜下纤维性变等,可通过上皮异常增生等一系列复杂过程发展为口腔鳞状细胞癌。尽管已有多种技术应用于口腔上皮异常增生和口腔鳞状细胞癌的治疗,但疗效尚不理想,口腔鳞状细胞癌的死亡率仍然较高。因此,亟待研制出高效、安全的防治口腔上皮异常增生和口腔鳞状细胞癌的药物。程序性细胞死亡配体1（programmed cell death-ligand 1,PD-L1）常在肿瘤细胞表面过表达,可与淋巴细胞表面的程序性细胞死亡受体1（programmed cell death receptor 1,PD-1）结合,抑制宿主细胞的免疫功能,是肿瘤免疫疗法的重要靶点。PD-L1的表达水平与多种癌症的进展及预后相关,但在口腔上皮异常增生和口腔鳞状细胞癌中的机制尚不明确,PD-L1表达水平与不同临床病理参数之间的关系尚存争议。全反式维甲酸（all-trans retinoic acid,ATRA）是维生素A的衍生物,可抑制头颈部鳞状细胞癌等多种癌细胞增殖,并诱导细胞凋亡。外用全反式维甲酸是治疗口腔白斑的有效手段。但是,其在口腔上皮异常增生及口腔鳞状细胞癌中的抗肿瘤作用机制尚不明确。全反式维甲酸是一种高亲脂性的分子化合物,生物相容性低,稳定性差,副作用强,因此在临床应用中受到限制。本课题旨在研究PD-L1在口腔白斑及口腔鳞状细胞癌中的表达及其与CD8淋巴细胞浸润、各临床病理特征的关系。阐明全反式维甲酸通过抑制STAT3信号通路治疗口腔上皮异常增生及口腔鳞状细胞癌的作用机制。我们进一步将全反式维甲酸包载于PLGA-PEG两亲性嵌段聚合物纳米载体中,以提高药物稳定性及生物相容性,应用PD-L1单克隆抗体进行纳米粒表面修饰,赋予纳米药特异性结合过表达PD-L1的口腔上皮异常增生及口腔鳞状细胞癌细胞的能力,以实现药物靶向输送。本课题内容分为以下三部分:第一部分PD-L1在口腔白斑和口腔鳞状细胞癌中的表达目的:以PD-L1为靶点的单克隆抗体已成为肿瘤免疫疗法的研究热点。肿瘤中高表达的PD-L1可抑制CD8+浸润淋巴细胞的功能。本研究旨在定量分析PD-L1在口腔白斑及口腔鳞状细胞癌中的表达水平,并探讨其与CD8表达及不同临床病理特征的关系。方法:采用免疫组化检测21例口腔白斑、41例口腔鳞状细胞癌和25例正常黏膜组织中PD-L1和CD8的表达。用染色评分法分析PD-L1在口腔白斑和口腔鳞状细胞癌病损组织中的阳性细胞染色率。用Image Pro-Plus计算积分光密度值（integrated optical density,IOD）以定量PD-L1和CD8的阳性表达水平。分析PD-L1与CD8表达水平及各临床病理特征的相关性。结果:在61.9%的口腔白斑、97.6%口腔鳞状细胞癌和0%的正常对照组织中PD-L1蛋白表达呈阳性。与正常对照组相比,PD-L1在口腔白斑和口腔鳞状细胞癌组织中的IOD水平均显著升高（P＜0.0001）,且PD-L1在口腔鳞状细胞癌组织中的IOD值显著高于口腔白斑组（P＜0.0001）。PD-L1在口腔白斑及口腔鳞状细胞癌组织中的IOD值与CD8阳性染色IOD值呈显著正相关（P＜0.0001,r=0.8491）。口腔白斑患者PD-L1阳性表达与性别、吸烟有关（P＜0.05）,与年龄、饮酒、异常增生程度无关（P＞0.05）。在口腔鳞状细胞癌患者中,PD-L1高表达组患者总体生存率和无病生存率有升高趋势,但差异不显著。PD-L1在口腔鳞状细胞癌中的表达与病理分级呈正相关（P＜0.0001）,但与年龄、性别、吸烟、饮酒、肿瘤大小、淋巴结转移、复发无关（P＞0.05）。结论:PD-L1在正常组织、口腔白斑和口腔鳞状细胞癌中的表达逐渐升高,且与CD8表达呈显著正相关,提示PD-L1表达水平可能与疾病进展和CD8+淋巴细胞浸润有关。第二部分全反式维甲酸通过阻断STAT3信号通路抑制口腔上皮异常增生和口腔鳞状细胞癌目的:近年来,全反式维甲酸在肿瘤治疗中显示出巨大的潜力。然而,其在抗癌作用中的潜在分子机制尚不清楚。本研究旨在探讨全反式维甲酸在口腔上皮异常增生和口腔鳞状细胞癌中的抗肿瘤作用。方法:用不同浓度的全反式维甲酸培养口腔上皮异常增生细胞系DOK和口腔鳞状细胞癌细胞系CAL27。采用CCK8试剂盒、流式细胞仪分别检测DOK与CAL27细胞的增殖、细胞周期、细胞凋亡及PD-L1表达水平。通过Western blot检测细胞周期相关蛋白cyclin A2和cyclin D1,细胞凋亡相关蛋白PARP、cleaved PARP和cleaved caspase-3,PD-L1蛋白及JAK2/ERK/STAT3通路相关蛋白的表达。检测用抑制剂S3I-201阻断STAT3信号通路后对上述蛋白表达的影响。结果:5μM-75μM全反式维甲酸均可抑制DOK和CAL27细胞增殖,分别将DOK和CAL27的细胞周期阻滞在G2/M期和S期,且可诱导细胞凋亡。全反式维甲酸可抑制p-STAT3、p-JAK2表达,上调p-ERK水平,并显著降低PD-L1表达。此外,阻断STAT3信号可促进cleaved caspase-3的表达（P＜0.001）,抑制cyclin A2和PD-L1的表达（P＜0.001）。阻断STAT3信号可显著增强全反式维甲酸对细胞生长抑制、凋亡诱导和PD-L1表达的影响（P＜0.05）。结论:在口腔上皮异常增生和口腔鳞状细胞癌中,全反式维甲酸可通过抑制STAT3信号通路下调PD-L1的表达,发挥抗肿瘤作用。第三部分PD-L1单克隆抗体修饰的全反式维甲酸纳米药在口腔上皮异常增生和口腔鳞状细胞癌中的免疫治疗作用目的:全反式维甲酸是治疗口腔白斑及各类癌症的有效药物,但全反式维甲酸的生物相容性低、稳定性差、副作用强,这些特点限制了该药在临床上的应用。本研究旨在评价PLGA-PEG作为纳米药物载体,在提高全反式维甲酸生物相容性和稳定性及减少毒副作用中的应用潜力,并通过PD-L1单克隆抗体表面修饰以提高纳米药的靶向性,增强肿瘤免疫。方法:将全反式维甲酸包载于PLGA-PEG纳米载体中,用PD-L1单克隆抗体进行表面修饰以制备ATRA-PLGA-PEG-PD-L1纳米药。采用纳米粒度电位仪、透射电镜和紫外可见分光光度计测定纳米药粒径分布、形态、多分散性指数、zeta电位、稳定性、包封率、载药量和体外释药。在口腔上皮异常增生细胞系DOK、口腔鳞状细胞癌细胞系CAL27和口腔角质形成细胞系KC中分别采用共聚焦显微镜、CCK8和流式细胞仪进行体外细胞摄取、细胞毒性和凋亡诱导实验。在C3H荷瘤小鼠体内通过小动物活体成像系统和成瘤实验进行药物生物分布、药物安全性和抑瘤作用检测。取小鼠瘤体组织进行多色免疫荧光染色,分析Ki-67、CD8和PD-L1蛋白表达情况。结果:全反式维甲酸和PLGA-PEG的最佳投料比为1:12。ATRA-PLGA-PEGPD-L1纳米粒在透射电镜下呈球形,平均粒径、zeta电位和多分散性指数分别为105.62±1.13 nm、-5.3±0.4 m V和0.193±0.011。纳米药储存10天后未出现降解或沉淀现象。ATRA-PLGA-PEG-PD-L1纳米药可被DOK和CAL27细胞快速摄取,且可显著抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡。此外,在C3H荷瘤小鼠中,ATRAPLGA-PEG-PD-L1纳米药比ATRA原药对肿瘤细胞的靶向性和抑制作用更强,且毒副作用更低。经纳米药治疗后的小鼠肿瘤组织中Ki-67表达降低,且PD-L1阳性表达的细胞周围可见大量CD8+肿瘤浸润淋巴细胞。结论:ATRA-PLGA-PEG-PD-L1纳米药具有毒性低、生物相容性高、稳定性好、靶向性强等优点,可在体内外特异性结合口腔上皮异常增生细胞和口腔鳞状细胞癌细胞,进而发挥免疫治疗作用。