苹果属小金海棠MxbHLH18与MxbHLH30基因的克隆与功能分析

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本研究通过对苹果属小金海棠(Malus xiaojinensis Cheng et Jiang)进行克隆分析,获得了两个bHLH家族基因,分别命名为MxbHLH18和MxbHLH30。分别分析MxbHLH18和MxbHLH30两个基因的生物信息学、基因功能、亚细胞定位和表达模式等。构建MxbHLH18和MxbHLH30基因的过表达载体,将过表达载体通过农杆菌介导转化法导入拟南芥,得到转基因植株。为了分析MxbHLH18和MxbHLH30的基因功能,对转MxbHLH18、MxbHLH30基因拟南芥进行缺铁、高铁和盐胁迫处理,最后对所有拟南芥株系进行相关生理指标和形态的检测与分析。研究结果如下所示:(1)通过PCR扩增技术获得了两个bHLH转录因子基因:MxbHLH18和MxbHLH30。MxbHLH18的开放阅读框全长为1025 bp,其翻译的蛋白序列含有341个氨基酸;MxbHLH30的开放阅读框全长为1050 bp,其蛋白序列包含349个氨基酸。序列比对和蛋白质结构预测同时表明这两个蛋白均具有保守的bHLH结构域,分别与苹果MdbHLH18和MdbHLH30的同源性最强。(2)亚细胞定位结果表明,MxbHLH18和MxbHLH30蛋白均定位在细胞核上。(3)q-PCR结果表明MxbHLH18和MxbHLH30在小金海棠新叶、老叶、根和茎中的表达具有特异性。MxbHLH18和MxbHLH30在新叶和根中的表达量都较高。低铁、高铁、盐和低温等非生物胁迫都能够诱导MxbHLH18和MxbHLH30基因的表达,但这两个基因对于低铁、高铁和盐胁迫的敏感性较强。(4)构建MxbHLH18和MxbHLH30过表达转基因拟南芥,并对野生型拟南芥(WT)、空载型拟南芥(UL)和转基因拟南芥分别进行低铁、高铁和盐胁迫处理,结果表明野生型和空载型拟南芥的表型和存活率明显不如转MxbHLH18、MxbHLH30基因拟南芥。(5)对所有拟南芥株系进行生理生化指标的测定,在低铁和高铁胁迫下,转MxbHLH18、MxbHLH30基因拟南芥的主根长、鲜重、铁元素含量、脯氨酸和叶绿素含量以及SOD、POD和CAT的活性均显著高于野生型和空载拟南芥,转MxbHLH18、MxbHLH30基因拟南芥的MDA含量升高幅度又相对较低,这说明了转MxbHLH18、MxbHLH30基因拟南芥的抗铁胁迫能力较强。在盐胁迫处理下,转MxbHLH18、MxbHLH30基因拟南芥中过氧化氢、超氧阴离子、脯氨酸和叶绿素含量以及SOD、POD和CAT的活性都显著高于野生型和空载拟南芥,转MxbHLH18、MxbHLH30基因拟南芥的MDA含量和相对电导率升高幅度又相对较低,这说明了转MxbHLH18、MxbHLH30基因拟南芥具有更强的耐盐性。(6)MxbHLH18和MxbHLH30能够上调铁胁迫相关下游关键基因At IRT1、At FRO2、A t N A S 2、A t A C T 2、A t Z I F 1和A t O P T 3的表达。因此,转MxbHLH18、MxbHLH30基因拟南芥可能能够通过还原转运Fe3+途径提高转基因拟南芥的抗低铁能力。(7)MxbHLH18和MxbHLH30上调At KIN1、At COR15a、At CBF1、At CBF2、At CBF3和At COR15b的表达,这说明了MxbHLH18和MxbHLH30可能能够通过调控ABA的合成和信号转导进而提高植物耐盐性。因此,本研究利用与抗铁和抗盐功能直接相关并且已获得基因全长的转录因子基因MxbHLH18和MxbHLH30,将它们与超表达载体连接后导入拟南芥植株中,发现转MxbHLH18、MxbHLH30基因拟南芥的抗高铁性、抗低铁性和抗盐性均显著增强。这一研究结果不仅为培育抗铁铁和抗盐苹果砧木提供了有利帮助,也为创新苹果种质资源提供了新的候选基因。
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