常染色体隐性遗传多囊肾疾病(autosomal recessive polycystic kidney disease，ARPKD)，也称多囊肾肝病(polycystic kidney and hepatic disease，PKHD)，是一种儿童肾脏及肝脏相关的严重的遗传病，患者均婴幼儿时期起病，故又称小儿多囊肾病(infantile polycystic kidney disease，IPKD)，发病率为1：20，000～1：40，000。ARPKD的主要病理特点是肾脏集合管囊样扩张并伴有不同程度的胆囊发育不全、胆管扩张以及先天性的肝门静脉纤维化。在胎儿期发病的患者主要临床表现为肾脏肿大和羊水过少，约30％的患者出生后很快就因为肺发育不全导致的呼吸功能障碍而死亡，但存活过围产期的患者15年生存率可达80％，患者的发病和死亡主要与严重的系统性的高血压、肾功能不全和汇管区纤维化导致的门脉高压有关。目前尚无有效的治疗方法。患者需要进行肾脏或肝脏移植，甚至需要做肝肾联合移植。 Zerres K等使用6个微卫星标记，对16个ARPKD家系进行连锁分析，证实PKHD1基因突变导致ARPKD，并将其定位于染色体6p21上。PKHD1基因最大的开放阅读框编码的蛋白命名为polyduetin/fibrocystin，由4074个氨基酸残基组成。PKHD1基因具有明显的组织表达特异性，在肾脏中，PKHD1广泛地在集合小管、远曲小管和髓绊(Henles loop)升枝粗段表达。在肝内胆管上皮细胞，胰腺导管和肾小管上皮细胞中，PKHD1也呈阳性。电镜和免疫荧光显示，fibrocystin定位于细胞的顶端的纤毛中的基底小体。目前，对该基因功能及其编码的蛋白功能了解不多，PKHD1基因在ARPKD发病中的作用也不清楚。基于以上背景，本文通过构建小鼠Pkhd1条件性基因剔除打靶载体，为进一步进行ES细胞同源重组，获得Pkhd1基因条件性基因剔除动物模型打下基础。同时，通过RNA干扰技术抑制PKHD1基因表达，研究 PKHD1基因对EGF诱导的细胞过度增生的影响及其机制，可能对阐明 ARPKD发病机制和PKHD1基因功能有一定作用。其结果如下： 1.构建小鼠Pkhd1条件性基因剔除打靶载体：以正常小鼠(129/SvJ)基因组DNA为模板，扩增小鼠包括第6号外显子的Pkhd1基因部分序列，通过引入LoxP和Neo基因等步骤，建立条件性剔除Pkhd1基因第6号外显子的条件性基因打靶载体。构建完成的Pkhd1基因条件性剔除打靶载体的5同源臂为3.5 kb，3同源臂为4.7 kb。选择性标记基因Neo基因和Pkhd1基因外显子6位于loxP之间。载体经XhoI酶切呈线性化，大小为15.3kb；PvuI酶切后得到2.1kb，13.2kb两个片段；CpoI酶切后得到5.9kb，9.4kb；XhoI/CpoI双酶切后得到1.6kb、4.3kb、9.4kb 3个片段；与预期的酶切结果相符合。经测序证实，构建的小鼠Pkhdl基因条件性打靶载体符合设计要求。 2.PKHD1基因shRNA表达载体的构建及PKHDI-silenced HEK-293T细胞株的建立：将PKHD1 shRNA1、PKHD1 shRNA2和HK-A序列克隆入pGenesil-2质粒构建了相应的shRNA表达载体。分别转染HEK-293T细胞，与未转染的HEK-293T细胞比较，PKHD1 shRNA1和PKHD1 shRNA2质粒转染HEK-293T细胞24、48小时后，PKHD1 mRNA表达水平都有不同程度的降低(P<0.05)，其中PKHD1 shRNA2质粒转染48小时后，PKHD1 mRNA的表达水平降低程度最大，抑制率达到75.91％。而转染pGenesil-2和HK-A质粒的HEK-293T细胞中PKHD1 mRNA的表达水平与未转染的HEK-293T细胞相比，无显著改变。使用PKHD1 shRNA2质粒转染HEK-293T细胞建立PKHD1shRNA2稳定转染细胞株。通过检测稳定转染细胞株中PKHD1 mRNA的表达水平，PKHD1 mRNA的表达水平降低了83.63％，而转染pGenesil-2和HK-A质粒的细胞中PKHD1 mRNA的表达水平无明显变化。 3.PKHD1 knockdown可显著增高EGF诱导的ERK1/2信号通路活化，从而导致细胞异常增生：分别检测了EGF对HEK-293T细胞、稳定转染pGenesil-2的HEK-293T细胞、稳定转染HK-A的HEK-293T细胞，PKHD1-silenced HEK-293T细胞增生率的影响。发现PKHD1-silencedHEK-293T细胞对EGF作用高度敏感，增生率为231.5％，明显高于HEK-293T细胞的152.8％(P<0.01)，而稳定转染pGenesil-2或HK-A的HEK-293T细胞增生率分别为163.5％和155.5％，与HEK-293T细胞比较，则无显著区别(P>0.05)。运用ERK1/2磷酸化的特异性抑制剂PD98059处理上述各组细胞后，细胞对EGF诱导的细胞增生明显降低。通过检测EGF对上述各组细胞的ERK1/2磷酸化的影响，发现PKHD1-silencedHEK-293T细胞的ERK1/2磷酸化水平明显高于HEK-293T细胞，而稳定转染pGenesil-2或HK-A的HEK-293T细胞则无显著差别。 4.PKHD1 knockdown降低了HEK-293T细胞内Ca<2+>浓度：运用激光共聚焦显微镜检NHEK-293T细胞、稳定转染pGenesil-2的HEK-293T细胞、稳定转染HK-A的HEK-293T细胞，PKHD1-silenced HEK-293T细胞各组细胞的细胞内Ca<2+>浓度。与HEK-293T细胞比较，PKHD1-silencedHEK-293T细胞的细胞内Ca<2+>浓度显著降低(p<0.001)。而稳定转染pGenesil-2或HK-A的HEK-293T细胞的细胞Ca<2+>浓度无显著变化(p>0.05)。 5.细胞内Ca<2+>异常的降低导致了EGF诱导的ERK1/2信号通路的过度活化，从而引起细胞的过度增生：运用Ca<2+>通道阻断剂Verapamil可降低细胞内Ca<2+>浓度。随着Verapamil剂量的增加，细胞内Ca<2+>浓度明显降低，呈剂量依赖关系。当细胞运用Verapamil处理4小时后，再加入20ng/ml EGF继续培养24小时后，与未经Verapamil处理的HEK-293T细胞比较，细胞增生率为202.2％，显著增高。如果同时加入ERK1/2磷酸化的抑制剂PD98059(20μM)，则细胞增生率显著降低。通过检测EGF对上述各组细胞的ERK1/2磷酸化的影响，发现Veralpamil处理的HEK-293T细胞的ERK1/2磷酸化水平明显高于未处理的HEK-293T细胞。Ca<2+>通道激活剂Bay K8644能以剂量依赖的方式增高细胞内Ca<2+>浓度。Bay K8644增高细胞内Ca<2+>浓度对细胞增生并无显著影响，但却显著降低了EGF诱导的PKHD1-silenced HEK-293T细胞的增生率(135.5％)。检测EGF对上述各组细胞的ERK1/2磷酸化的影响，发现Bav K8644处理的PKHD1-silencedHEK-293T细胞的ERK1/2磷酸化水平明显低于未处理的细胞。 综上所述，构建的小鼠Pkhd1基因条件性基因剔除打靶载体符合设计要求，为进一步进行ES细胞同源重组，获得Pkhdl基因条件性基因剔除小鼠模型打下基础。同时，RNA干扰实验研究结果表明，PKHDl基因表达降低可显著增高EGF诱导的细胞增生，细胞内Ca<2+>异常的降低导致了EGF诱导的ERK1/2信号通路的过度活化，从而引起细胞的过度增生。结果提示，在ARPKD患者中，由于PKHD1基因的突变导致fibrocystin表达降低，引起细胞内Ca<2+>浓度降低。从而导致EGF诱导的ERK1/2信号通路过度活化，导致ARPKD患者肾上皮细胞异常增生，这可能是ARPKD肾囊肿发生的机制之一。