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研究目的:采用全骨髓贴壁法筛选大鼠骨髓间充质干细胞,并进行传代培养及鉴定,同时制备急性肝衰竭伴内毒素血症模型大鼠,通过观察清热解毒凉血化瘀中药联合BMSCs移植对模型大鼠肝组织中TNF-α、iNOS的基因转录及肝组织中核因子NF-κB表达的影响来探讨该联合方法对急性肝衰竭时炎症反应的作用机制。研究方法:1.大鼠BMSCs分离、培养及传代筛选:无菌条件下取出大鼠双侧股骨及胫骨,并在超净工作台中冲洗出骨髓,接种于含10%胎牛血清的培养基中,定期换液,倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况,并对所培养的细胞进行鉴定。2.急性肝衰竭大鼠模型的建立并验证取体重约为180g-200g健康级SD雄性大鼠,硫代乙酞胺(TAA)以400mg/(kg·d)的剂量灌胃,间隔24h后重复给药1次。设置正常组,给予2ml生理盐水灌胃。造模48h后将存活的大鼠采血、取肝,以检测血清肝功指标和血浆内毒素水平,制作肝组织病理切片,镜下观察肝脏结构及炎性细胞浸润情况,对比正常组,以验证造模是否成功。3.急性肝衰竭大鼠实验分组及干预体重约为180g-200g健康级SD雄性大鼠60只,随机分为正常组(A组)、TAA模型组(B组)、TAA+甘草酸苷治疗组(C组)、TAA+中药治疗组(D组)、TAA+BMSCs治疗组(E组)、TAA+BMSCs+中药组治疗组(F组),每组10只。b组、c组、d组、e组、f组给予400mg/kgtaa灌胃,间隔24h后重复给药1次,制备alf大鼠模型。a组给予2ml生理盐水灌胃。第2次灌胃后将bmsc(约1x107个细胞/只)经尾静脉注射到e、f组大鼠体内,a、b、c、d组大鼠经尾静脉注射等体积的用于培养bmsc的培养液,24h后重复尾静脉注射1次。第1次尾静脉注射后立即予以d、f组大鼠茵陈四苓颗粒灌胃;c组予以甘草酸苷灌胃;a组、b组、e组予以等体积蒸馏水灌胃。干预治疗72h后采血、取肝,检测血清肝功指标、血浆内毒素含量;免疫组化法检测肝组织中nf-κb的表达;rt-pcr法检测肝组织tnf-α、inos的基因转录情况。研究结果:1.成功分离出贴壁生长的细胞,经过3次传代筛选后细胞形态逐渐趋向一致,以梭形为主,呈旋涡状、网状或放射状排列。p3代细胞经流式细胞仪鉴定结果显示:cd29、cd44细胞阳性率分别为98.2%和97.9%,而cd34、cd45细胞阳性率分别为12.9%和18.7%,符合骨髓间充质干细胞表面抗原表达的特点。2.急性肝衰竭模型的验证:taa模型组血清ast、alt及血浆内毒素水平较正常组均明显升高,差异有统计学意义(p<0.01)。taa模型组肝组织he染色显示:肝索结构大部分被破坏,肝细胞出现片状坏死、凋亡,大量炎症细胞浸润。正常组肝组织he染色:肝组织细胞排列规律,结构规整,细胞形态正常,无炎症细胞浸润。3.急性肝衰竭模型大鼠经干预后的情况:(1)alt、ast及内毒素水平结果显示:采取治疗的4组(c、d、e、f)大鼠血清ast、alt及血浆内毒素水平明显低于模型组(b组),差异有统计学意义(p<0.01);但各治疗组与正常组(a组)对比,ast、alt、内毒素水平仍高,差异有统计学意义(p<0.01);各治疗组相比较,f组大鼠血清ast、alt及血浆内毒素水平较c、d、e组低,差异有统计学意义(p<0.01);c、d、e三组之间比较,差异无统计学意义(p>0.05)。(2)rt-pcr结果显示:a组肝组织中有少量tnf-α、inos的基因转录。b、c、d、e、f组与a组相比,tnf-α、inos的基因转录水平明显升高,差异有统计学意义(p<0.01)。采取治疗措施的c、d、e、f组大鼠肝组织中tnf-α、inos的基因转录水平均明显低于模型组(b组),差异有统计学意义(p<0.01);各治疗组间比较,f组tnf-α、inos的基因转录水平较c、d、e三组低,差异有统计学意义(p<0.01);c、d、e三组tnf-α、inos的基因转录水平差异无统计学意义(p>0.05)。(3)免疫组化结果显示:a组肝组织有少量细胞的胞质或胞核内可见nf-κb的表达。灌胃taa的其他五组与a组相比较,表达nf-κb的细胞数目明显增多,差异具有显著统计学意义(p<0.01)。经干预后,各治疗组(c、d、e、f组)与模型组(b组)相比,nf-κb表达明显降低,差异有统计学意义(p<0.01),与a组相比,nf-κb表达仍然很高,差异有统计学意义(p<0.01)。各治疗组间比较,f组表达nf-κb的细胞数目较c、d、e组有所减少,差异有统计学意义(p<0.05),而c、e、f三组表达nf-κb的细胞数目相近,差异无统计学意义(p>0.05)。研究结论:1.采用全骨髓培养法可成功获得较高纯度的bmscs,且该方法简便、快捷、经济,可作为实验室分离提取bmscs的常用方法。2.以400mg/(kg·d)剂量的TAA灌胃,每天1次,共灌胃2天,能够成功建立急性肝衰竭伴内毒素血症大鼠模型。3.肝衰竭时茵陈四苓颗粒、BMSCs移植均能够降低血浆内毒素含量,两者联合效果更明显。4.肝衰竭时陈四苓颗粒、BMSCs移植均能够抑制NF-KB的激活,两者联合效果更明显。5.肝衰竭时茵陈四苓颗粒、BMSCs移植均能够减少炎性因子TNF-α、iNOS生成减少,两者联合效果更明显6.茵陈四苓颗粒联合BMSCs移植能够明显减轻肝衰竭时肝内失控性炎症反应,其机制可能是与减少内毒素的生成及吸收,抑制炎症信号通路NF-KB激活,从而减少其下游炎性因子TNF-α、iNOS生成有关,且两者具有协同作用。