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目的:利用昆虫杆状病毒表达系统重组表达MERS-Co V S1和RBD蛋白,明确其作为重组疫苗靶抗原的免疫原性和诱导中和抗体的能力;利用制备的S1重组蛋白筛选制备具有中和活性的抗MERS-Co V单克隆抗体。方法:(1)构建含有MERS-Co V S1基因的重组杆状病毒质粒,转染SF9细胞包装杆状病毒。重组病毒传代3次获得种子病毒,感染Sf9细胞,收获感染上清,通过镍离子亲和层析纯化获得S1重组蛋白。利用纯化的S1蛋白免疫BALB/c小鼠,通过ELISA检测免疫小鼠血清抗原特异性的抗体水平;通过假病毒以及活病毒中和试验检测血清中抗体的中和活性。同时利用重组表达S1蛋白免疫BALB/c小鼠,将免疫后小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,通过ELISA筛选出阳性克隆,随后通过多次亚克隆筛选出稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株,制备单抗腹水并进行抗体效价测定及亚类鉴定;通过MERS-Co V假病毒及活病毒中和试验筛选出中和单抗。(2)利用生物信息学方法对MERS-Co V S1基因序列、二级结构、柔性分析;同时对MERS-Co V RBD、MERS-Co V单克隆抗体及MERS-Co V RBD与细胞受体DPP4结合的晶体结构进行分析预测在S1内部具有免疫保护功能区段355-590aa;针对预测的免疫功能保护区设计添加foldon序列,构建含有MERS-Co V RBD、MERS-Co V RBD Fd基因的重组杆状病毒质粒,转染SF9细胞包装杆状病毒。重组病毒传代3次获得种子病毒进而感染Sf9细胞,收获感染上清,通过镍离子亲和层析纯化获得RBD、RBDFd重组蛋白。利用纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,通过ELISA检测免疫小鼠血清抗原特异性的抗体水平;通过假病毒以及活病毒中和试验检测血清中抗体的中和活性。结果:(1)获得了表达MERS-Co V S1蛋白的重组病毒株,并在昆虫细胞中成功表达和纯化了分子量约140k D S1重组蛋白。利用重组表达的S1蛋白免疫小鼠三次,血清S1特异性Ig G抗体滴度可达1:102400;免疫小鼠血清稀释5120倍后中和百分比仍能达到50%以上,且具有良好的活病毒中和活性。(2)利用重组的MERS-Co V S1蛋白筛选获得了10株能够稳定分泌抗原特异性单抗的杂交瘤细胞株。制备的腹水单抗亚类为6株为Ig G1型,2株为Ig G2a型,2株为Ig M型;10株单抗抗体ELISA效价达到10000以上,并获得1株单抗对MERS-Co V具有良好的中和活性。(3)获得了表达MERS-Co V RBD、MERS-Co V RBD Fd蛋白的重组病毒株,在昆虫细胞中成功表达并纯化了分子量约40k D MERS-Co V RBD单体重组蛋白以及分子量约100k D MERS-Co V RBDFd寡聚体蛋白。利用重组表达的RBD单体蛋白免疫小鼠三次,血清MERS-Co V RBD特异性Ig G抗体滴度可达1:6400;免疫小鼠血清稀释3200倍后中和百分比低于50%,对MERS-Co V假病毒的中和活性较弱。而利用形成寡聚体的RBD蛋白在一次加强免疫后,血清中MERS-Co V RBDFd特异性Ig G抗体滴度可达1:102400;免疫小鼠血清稀释12800倍后中和百分比仍高于50%。结论:利用昆虫细胞重组表达的MERS-Co V S1蛋白具有良好的免疫原性,并能够有效诱导产生高滴度保护性中和抗体,筛选制备出一株具有良好中和活性的MERS-Co V单克隆抗体。重组表达的MERS-Co V RBD单体蛋白免疫原性以及对假病毒中和活性都较弱;利用昆虫细胞重组表达的MERS-Co V RBDFd寡聚体重组蛋白具有很强的免疫原性,能够有效诱导产生高滴度中和抗体,对MERS-Co V假病毒以及活病毒都具有很好的中和活性。该研究为发展一种安全有效的针对MERS-Co V的预防疫苗奠定了坚实基础。图35幅,表4个。参考文献57篇。