第一部分假单胞菌属WBC-3菌株4-硝基苯酚代谢途径中关键蛋白PnpB和PnpE结构和功能的研究4-硝基酚(对硝基苯酚,PNP)是一种重要的化工原料,对人体有很强的毒性与致癌性。硝基酚类化合物可以抵抗一般生物氧化酶的攻击,因此进入环境的对硝基苯酚会长期残留在土壤和水中,对动植物生存、人类健康产生了很大的威胁。目前,降解环境中的对硝基苯酚仍然是一个世界性的难题。用传统的物理和化学方法进行处理,工艺复杂、成本高,而且容易产生二次污染,不能完全清除污染物。研究发现利用微生物来实现污染物的去除,及微生物修复技术,不仅能够实现污染物的完全脱毒,而且没有复杂的前处理或抽提过程,因此是一种环境友好的污染治理方法。4-硝基酚的微生物代谢研究一直受到人们的关注,目前已有多株能够完全代谢4-硝基酚的细菌纯培养物的报道。与此同时,关于4-硝基酚代谢的分子机制的研究也受到了广泛的关注。研究发现微生物降解4-硝基酚的途径主要有两条,根据中间产物的不同,分为对苯二酚途径和偏苯三酚途径。对苯二酚代谢途径广泛存在于革兰氏阴性菌中,以Moraxella菌研究为代表(Spain,1991)。在该途径中,4-硝基酚首先被氧化为对苯二醌(p-benzoquinone),对苯二醌在还原酶作用下还原为对苯二酚(hydroquinone),然后进入开环途径。偏苯三酚途径大多存在于革兰氏阳性菌中,以Arthrobacter sp.JS443(Jain,1994), Bacillus sphaericus JS905 (Kadiyala,1998)为代表,在该途径中,4-硝基酚在2-和3-位羟化形成苯三酚(1,2,4-benzenetriol,hydroxyquinol),进入开环途径。目前,分子生物学研究已经获得了对苯二酚代谢的完整的基因簇,并且鉴定了参与代谢途径的关键酶的功能。其中4-硝基酚单加氧酶(PnpA)催化4-硝基酚氧化为对苯二醌,对苯二醌还原酶(PnpB)催化对苯二醌还原为对苯二酚。参与4-硝基酚下游代谢途径的酶包括：PnpCD是对苯二酚双加氧酶的α和β亚基,催化对苯二酚开环生成γ-羟基粘康酸半醛；PnpE是γ-羟基粘康酸半醛脱氢酶,催化γ-羟基粘康酸半醛生成马来酰乙酸；PnpF是马来酰乙酸还原酶催化马来酰乙酸生成p-酮己二酸酯,继而进入中心代谢途径(TCA循环)。为了进一步研究每一步酶催化反应的化学机制,需要对每一步的酶的三维结构进行测定。因此本论文运用X射线晶体学方法在原子水平上测定了Pseudomonas sp.WBC-3中参与降解PNP反应的酶PnpB与PnpE的三维结构及其与辅因子的复合物的三维结构。研究了这两种蛋白质的折叠类型、活性中心的结构与氨基酸组成,从分子水平上深入阐述其催化机理及催化动力学过程。主要内容包括以下几个方面：(1) Apo-PnpB, PnpB-FMN复合物晶体的获得和结构的解析。首先克隆Pseudomonas sp. WBC-3中的pnpB基因,构建表达质粒后将其转化到大肠杆菌中,获得阳性克隆子之后,纯化重组蛋白质,将重组蛋白质进行晶体的生长。晶体进行优化后,通过X射线衍射,apo-PnpB和PnpB-FMN复合物晶体分别得到了2.1A和1.7A的数据,最终解析出了两者的蛋白质结构。(2) Apo-PnpE, PnpE-NAD复合物晶体的获得和结构的解析。通过克隆Pseudomonas sp. WBC-3中的PnpE基因,将其转化到大肠杆菌中获得阳性克隆子之后,纯化重组蛋白质,将重组的蛋白质进行晶体的生长。晶体进行优化后,通过X射线衍射,apo-PnpE和PnpE-FMN复合物分别得到了2.7A和3.0A的数据,最终解析出了两者的蛋白质结构。(3)解析了apo-PnpB, PnpB-FMN的结构,确定了PnpB具有βαβ典型的黄素氧还蛋白特征结构域。阐明了辅因子FMN在PnpB中的位置,以及PnpB中与FMN相互作用的氨基酸。并且通过Autodock的方法得到了PnpB-FMN-BQ和PnpB-FMN-NADPH的结构模型,通过此模型研究了PnpB结合底物BQ的活性位点的结构,以及与BQ相互作用的关键氨基酸,并通过生化定点突变进行验证。研究了PnpB另外一个辅因子NADPH与PnpB的相互作用。确定了PnpB与NADPH相互作用的氨基酸,并且也通过生化定点突变进行验证。并从分子水平上给出了PnpB催化底物对苯醌的反应机制。(4)解析了apo-PnpE, PnpE-NAD的结构,确定了PnpE底物结合结构域,辅因子结合结构域以及二聚化的结构域。弄清了辅因子NAD在PnpE中的位置,以及PnpE与NAD相互作用的氨基酸。通过比较PnpE-Native和PnpE-NAD的结构,发现了一段与NAD结合有关的loop(Leu246-Gly252),在催化机制中的作用。通过比较PnpE与同源蛋白BADH的结构,我们阐明了PnpE辅酶特异性结合辅因子的结构基础。利用Autodock分子对接的方法我们得到了PnpE与底物γ-羟基粘糠醛(y-hydroxymuconic semialdehyde)复合物的结构模型,阐明了PnpE与底物相互作用的九个氨基酸在催化反应中的作用,并通过生化定点突变进行了验证。第二部分古菌嗜酸热原体F3因子作为抗癌药物筛选与设计靶点的晶体学结构研究癌症是人类健康的一大杀手,每年都要吞噬数百万人的生命,致使人们”谈癌色变”。恶性肿瘤细胞具有明显的浸润与转移特性,这是导致病人死亡的主要原因。如何有效控制癌细胞的侵袭与转移是目前肿瘤治疗的关键。肿瘤细胞转移涉及到肿瘤细胞的粘附、酶对基质的降解、新血管形成等一系列复杂的过程。其中肿瘤细胞和它周围微环境相互作用的蛋白降解酶对肿瘤的恶化起到了不可忽视的关键作用。这些蛋白降解酶包括基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs),纤溶酶原和氨肽酶(aminopeptidases, AP)。氨肽酶N(APN)就是其中一族与恶性肿瘤明显相关的降解酶,它广泛存在于动物细胞中,参与肿瘤细胞对基底膜、基质的侵入、对血管壁的穿透以及肿瘤细胞的转移。由于APN在癌细胞的侵袭与转移中发挥的重要作用,它也就成为抗癌药物研究的重要靶点。1987年APN抑制剂Bestatin(通用名为Ubenimex)作为免疫增强剂在日本上市。而近年来又发现了多种和Bestatin结构类似的小分子化合物,如：Probestin,Actinonin等。尽管针对APN的小分子抑制剂的研究比较多,但是人体氨肽酶三维结构还尚未被解析,这妨碍了该类药物与靶点作用的深入研究,使具有更高特异性药物的研究面临很大困难。在这种情况下对其同源蛋白质的结构研究会带来意想不到的新发现。当前有关APN的药物设计主要是利用E.coli与Bestatin复合物的结构作为模型,其问题在于E.coli的APN序列与人APN序列同源性仅为26%,而且其活性中心的5个氨基酸(G1u382,Arg293,Met260,lys319,Glu121)与人APN都不相同,这样在基于蛋白质的三维结构进行药物设计时就在一定程度上存在不可避免的偏差,影响最佳效果的实现。Thermoplasma acidophilum F3因子的氨基酸序列与人APN的同源性最高,达到33%,而且两者的活性位点中只有2个氨基酸不同(Glu101,Asn261)。本论文首先将这两个氨基酸进行突变(E101Q,N261T),获得活性位点与人APN完全一致的APN同源蛋白,因此这种同源性更高而且活性位点完全一致的同源蛋白质结构进行药物设计,将会大大提高药物设计的效率,得到具有更高特异性的药物。本文的工作和研究成果如下：(1)本章通过PCR的方法从Thermoplasma acidophilum基因组中克隆得到蛋白酶体相互作用F3因子的基因,利用定点突变的方法,将F3因子的101位谷氨酸突变成谷氨酰胺,261位天冬酰胺突变成苏氨酸。突变后的F3因子基因片段进行酶切后,连接到表达载体pET21b中,转化到大肠杆菌中进行表达,获得阳性克隆子。培养阳性克隆子使突变的F3因子大量表达,通过加热法,离子交换层析,凝胶过滤层析等一系列分离纯化的方法,最终获得纯度在90%以上的突变F3因子蛋白质。(2)利用已有的APN抑制剂(Dsh39,Bestatin,D24,Dsh27)与改造后的F3因子突变体共结晶,然后通过X-射线衍射技术对这四种晶体进行结构解析,最终只得到了化合物D24与F3因子突变体的复合物结构。而在其他三种晶体结构中没有发现相应化合物的电子密度。这也许是由于这些化合物是根据E.coliAPN的结构设计的,而其活性位点的结构与F3因子存在一定差别,因此以E.coliAPN三维结构设计的抑制剂,不能与F3因子形成稳定的化合物。(3)通过对F3因子与抑制剂D24复合物三维结构的分析,确定了相互作用的氨基酸,这些氨基酸分别是：Gln101,Ala229,Ala231,Glu233,Glu288,Thr292,Arg316和Glu352。F3因子与D24结合后活性位点锌离子配位发生了改变。F3因子与D24结合之前,锌离子与288位的谷氨酸及一个水分子形成配位,形成了一个四面体的结构,而在F3因子与D24形成的复合物中,化合物D24取代了水的位置与锌离子形成配位。(4)比较了F3因子101位谷氨酸突变成谷氨酰胺,261为天冬酰胺突变成苏氨酸后结构的变化。Apo-F3因子状态的两种结构(PDB：1Z1W和1Z5H)与突变的F3因子与化合物D24形成的复合物其活性位点的相对氨基酸残基位置发生了很大的变化。在1Z1W中,101位的谷氨酸由于和233位的谷氨酸同时带有负电荷,相互排斥,因此取向朝外。而在1Z5H的结构中,101位的谷氨酸取向虽然和233位的谷氨酸相对着,但由于带有相同的电荷,其构象并不是很伸展。但是在突变后的复合物结构中,101位的谷氨酸被谷氨酰胺所代替,由于不带负电荷,而且在化合物D24的稳定下,其侧链明显的是埋藏在内部。而261位天冬氨酰突变成苏氨酸后,其构象没有太大变化,只是增加了周围环境的疏水性。(5)通过比较E.coli的APN结合Bestatin的凹槽与突变F3因子结合化合物D24凹槽结构差异,提示了以E.coli APN作为模型设计人APN的抑制剂所存在的风险。E.coliAPN活性凹槽的体积明显比T.acidophilum中F3因子活性位点体积要小。这种结构的差异是由两者活性位点的氨基酸差异造成的。在底物结合的凹槽中,T.acidophilum的F3因子中的352位的甘氨酸代替了相同位置的大肠杆菌中的苯丙氨酸,还有其他四个氨基酸的改变造成了前者拥有一个更大体积的活性底物结合凹槽。所以,以E.coli的结构设计的抑制剂不能很紧的与F3因子结合,而突变的F3因子活性位点的五个氨基酸与人的APN是一致的,因此可以更好的模拟人的APN蛋白,作为药物设计的更好模型。(6)通过生化实验分析突变F3因子氨肽酶的Km值,最适反应温度,最适反应pH,发现Thermoplasma acidophilum突变F3因子是一种典型的米氏酶,以L-亮氨酰-p-硝基苯胺作为底物时其米氏常数为62.45μM。其酶活的最适反应温度是75℃,最适反应pH是5.5,另外,它也具有较强的热稳定性,在50℃水浴下处理150min依然可以保持较高的酶活。通过已有报道的APN阳性抑制剂(Bestatin, LYP, D24, A6)对基因改造的F3因子的抑制率与商品化APN抑制率比较实验,发现这些阳性抑制剂对二者的抑制趋势是一致的,说明基因改造的F3因子可以替代商品化的APN用于合成抑制剂的筛选。