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研究目的及背景:
严重腹腔感染是外科常见手术并发症和主要死亡原因。严重腹腔感染可引起肠粘膜损伤、肠通透性增加、肠屏障功能障碍、肠道细菌和内毒素易位,肠源性脓毒症,成为全身炎症反应综合症的细菌来源,导致多器官功能衰竭(Multiple organs failure,MOF),甚至危及生命。肠道是应激反应的中心器官和重要靶器官之一。肠粘膜屏障损伤是腹腔感染的主要原因,防治肠粘膜屏障功能损伤是改善腹腔感染预后和降低病死率的关键。肠粘膜上皮细胞(intestine epithelial cell,IEC)是肠屏障功能的核心。肠粘膜上皮损伤修复的机制尚不清楚,所以目前国内外均未能采取针对性有效措施来保护肠粘膜屏障功能。阐明腹腔感染肠粘膜上皮损伤修复的分子机制,对指导临床采取有效措施维护肠粘膜屏障功能,降低病人死亡率具有重要意义。
GLN(glutamine,GLN)是一种非必需的中性氨基酸,GLN缺乏时造成肠功能和免疫功能等受损,研究表明GLN可改善肠粘膜上皮细胞的代谢,有助于肠粘膜上皮细胞的修复、再生。小肠粘膜损伤的修复调控机制主要来自粘膜本身,研究表明,体内多种生物活性物质参与调解肠粘膜上皮细胞的增殖过程,腹腔感染时,GLN在肠粘膜长皮细胞损伤修复过程中的调控机制尚未清楚。
本研究通过建立大鼠腹腔感染模型,观察腹腔感染时血浆炎性细胞因子、肠粘膜上皮细胞凋亡和肠粘膜屏障功能的变化,探讨其在肠粘膜屏障损伤中的作用机制;观察GLN对腹腔感染时肠粘膜屏障的保护作用,探讨其在肠粘膜上皮细胞损伤修复过程中的作用机制。为临床采取有效措施维护肠粘膜屏障功能提供理论依据。
方法:
本课题通过盲肠结扎穿孔法(cecal ligation and puncture,CLP)制备大鼠腹腔感染模型。随即分成3组:腹腔感染组(CLP组),GLN治疗CLP组(GLN组,用0.5g/kg.d的GLN溶液灌胃,用生理盐水充分溶解成GLN溶液4ml,用灌胃针进行灌胃,2次/天)和假手术组(sham operation,OP组)。通过ELISA发观察血浆中TNF-a、IL-6炎性细胞因子水平的变化;偶氮显色鲎试剂定量测定法测定血浆中内毒素水平;分光光度法测定反映肠屏障功能变化的指标如血浆D-乳酸浓度和DAO活性;高压液相仪测定反应肠粘膜通透性的尿乳果糖和甘露醇比值(L/M);光镜观察肠粘膜上皮病理变化;TUNEL方法观察肠粘膜上皮细胞凋亡情况;免疫组化法测定肠粘膜组织中细胞凋亡基因BCL-2和BAX蛋白表达改变;并且对所得结果采用SPSS11.5软件进行相应的统计学分析。
结果:
1.CLP组小肠部分绒毛水肿、片状坏死、脱落,固有层血管充血、中性粒细胞浸润及淋巴细胞浸润、柱状上皮坏死。OP组和GLN组明显好于CLP组。CLP组肠粘膜厚度和绒毛高度较OP组比较,均明显下降(P<0.05),GLN组与CLP组比较,均有下降,在第3、7天时差异具有显著性。
2.CLP组大鼠处于全身炎症反应状态,与OP组相比较,CLP组血浆TNF-a、IL-6和LPS浓度明显升高(P<0.05);GLN组在3天和7天时血浆TNF-a、IL-6和LPS浓度比CLP组有明显下降(P<0.05),但在1天时IL-6和LPS浓度差异没有显著性。
3.大鼠经历CLP后出现肠屏障功能损害。与OP组相比,CLP组血浆中DAO活性、D-乳酸浓度显著升高(P<0.05),尿L/M值也显著升高(P<0.05)。GLN组与CLP组比较,第3天和7天时DAO活性、D-乳酸明显下降(P<0.05),第7天时尿L/M值明显下降(P<0.05)。
4.3天时CLP组大鼠肠粘膜上皮细胞凋亡指数较OP组相比具有明显升高(P<0.05);GLN组与CLP组比较,细胞凋亡指数显著性下降(P<0.05)。
5.3天时CLP组肠粘膜上皮凋亡基因BCL-2蛋白表达较OP组明显下降,BAX蛋白表达则明显升高;GLU组与CLP组比较:BCL-2蛋白表达升高,BAX蛋白表达下降,差异均具有显著性(P<0.05)。
结论:
本课题在建立了大鼠腹腔感染动物模型的基础上,在细胞和分子水平阐述了腹腔感染时肠粘膜屏障功能损害以及上皮细胞损伤修复的发生机制,并探讨GLN对腹腔感染肠屏障损害的保护作用及机制。结果表明腹腔感染引起肠粘膜屏障功能损害,GLN通过抗凋亡和减轻炎症反应等途径对CLP后肠屏障功能起到一定程度的保护作用。
1.腹腔感染时血浆炎性细胞因子TNF-a、IL-6和LPS水平增加,肠粘膜上皮细胞凋亡失调,细胞因子、LPS和肠粘膜上皮细胞凋亡共同参与了肠粘膜屏障的损伤机制。
2.GLN对腹腔感染时血浆炎性细胞因子和肠粘膜上皮细胞凋亡具有调控作用。
3.GLN通过多种途径对腹腔感染肠时粘膜屏障损伤具有保护作用。